Чувствительность тест системы пцр

ПЦР — это метод ДНК-диагностики, который позволяетвыделить в клиническом материале ничтожно малые количества определенного генетического материала, размножить и идентифицировать его.

Что такое ПЦР. Чувствительность и специфичность ПЦР.

ПЦР — это метод ДНК-диагностики, который позволяетвыделить в клиническом материале ничтожно малые количества определенного генетического материала, размножить и идентифицировать его.

Полимеразная цепная реакция, более известная как «ПЦР», не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Мюллисом в 1983 году, за что он был удостоен Нобелевской премии. Причина достаточно проста: ПЦР делает невозможное возможным. Часто её описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена. "Иглой" является крошечный фрагмент генетического материала – ДНК или РНК, а ПЦР не только точно его обнаруживает, но и позволяет, используя естественное свойство ДНК — репликацию (удвоение), получить множество его копий. Результат? В течение нескольких часов, в результате многократно повторяющихся температурных циклов полимеразной цепной реакции, из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, полимеразная цепная реакция является универсальным методом выявления специфических фрагментов ДНК или РНК в пробе с малым их содержанием.


Рис. Схема ПЦР

Изящность, простота исполнения в лабораторных условиях, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности полимеразной цепной реакции принесли новому методу небывалую популярность. За короткое время ПЦР-анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического использования. Метод нашёл применение в археологии, в практике судебной медицины, в области медицинской генетики, прежде всего, для оценки предрасположенности человека к некоторым онкологическим и генетическим заболеваниям. Но особенно широко ПЦР-анализ стал использоваться для диагностики различных инфекционных заболеваний, в частности, заболеваний, передающихся половым путём (ЗППП), диагностики вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции, туберкулёза, клещевого энцефалита, острых респираторных и кишечных инфекций и множества других. На сегодняшний день практически нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью метода ПЦР. Для диагностики некоторых урогенитальных инфекций, например, Mycoplasmagenitalium – возбудителя воспалительных заболеваний мочеполового тракта, ПЦР как метод молекулярной диагностики, стал "золотым стандартом", проверенным временем и тщательно апробированным клиниче

Достоинства ПЦР как метода молекулярной диагностики.
Метод ПЦР, в отличие от других, традиционно используемых для диагностики инфекционных заболеваний (иммуноферментный анализ (ИФА), бактериологический посев, микроскопия и др.), характеризуется целым рядом достоинств, которые позволили вывести лабораторную диагностику на качественно новый уровень.

1. Прямое определение наличия возбудителей Выявление методом ПЦР специфического участка ДНК возбудителя в клиническом материале дает прямое указание на присутствие конкретного возбудителя инфекции. В отличие, например, от иммуноферментного анализа, который, выявляя белки-маркеры – «продукты жизнедеятельности» инфекционного агента, дает опосредованное свидетельство наличия инфекции.

Возможность одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических методов, где для разных возбудителей используются разные способы культивирования.

2. Высокая cпецифичность
Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного микро-(макро)-организма участок его генетического материала. Согласно имеющимся данным, специфичность ПЦР-анализа для хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 95-99 %.

3. Высокая аналитическая чувствительность Любой лабораторный метод характеризуется таким показателем, как аналитическая чувствительность (АЧ). АЧ отражает то минимальное количество «возбудителя», которое обнаруживается данным методом в конкретном клиническом материале. Среди методов диагностики инфекционных возбудителей, ПЦР обладает наиболее высокими (до 99,7 %) показателями чувствительности за счет экспоненциального накопления продукта реакции – искомого фрагмента ДНК. Так, например, аналитическая чувствительность тест-систем, используемых для выявления большинства бактериальных инфекций, составляет 102 — 103 клеток (копий ДНК) в 1 мл биологической пробы. Для сравнения, чувствительность иммунологических и микроскопических тестов — 103 — 107 клеток.

Читайте также:  Почему нельзя купаться во время месячных

4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей
Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК или РНК возбудителя. Сходство химического состава нуклеиновых кислот всех микро-(макро)-организмов позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований, а также использовать для диагностики различный биологический материал: соскобы эпителиальных клеток урогенитального тракта, цельную кровь, плазму, сыворотку, мочу, сперму, секрет простаты, фекалии, плевральную и спинномозговую жидкости, мокроту, слюну, биоптаты различных органов и др. Материалом для исследования методом ПЦР могут служить вода, почва, продукты питания.

Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени как, например, при бактериологическом посеве, также нет необходимости сохранять возбудителя в живом состоянии. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при диагностике скрытых или хронических инфекций.

5. Скорость проведения анализа
Унифицированный метод обработки биоматериала, автоматизация процесса «размножения» искомого фрагмента ДНК и его последующей детекции как продукта реакции, дают возможность провести полный анализ в течение короткого времени (от нескольких часов до одного дня).

6. Возможность одновременной диагностики многих возбудителей (анаэробов и аэробов; вирусов, бактерий и грибов).

7. Для некоторых микроорганизмов ПЦР является практически единственным методом диагностики (например, для Mycoplasma genitalium).

Как это используется?

  • Диагностика инфекций
  • Генетические анализы, в том числе диагностика наследственных заболеваний
  • Исследования в судебной медицине и в других областях

Смотрите также:
ПЦР-диагностика инфекций в ООО «Лаборатории ЦИР»
Подготовка к исследованиям на инфекции методом ПЦР

З настанням тепла в лісах, парках і скверах активізуються кліщі. Тому, перебуваючи на природі, варто потурбуватися про власну безпеку, аби .

01.03.2017

тест AmniSure

Купить тест на определение подтекания околоплодных вод у беременных Амнишур Вы можете так же в аптеках г.Киева:
1. Аптеки "Арника" .

26.08.2016

ФЛОРОЦЕНОЗ

Комплексный тест нового поколения для диагностики ВСЕХ клинически значимых инфекций урогенитального тракта у женщин репродуктивного возраста. .

тел/факс +38(044) 501-70-64
моб +38(093) 329-64-04
вопросы о продукции
+38(044) 221-87-57

Правильное и своевременное лечение заболеваний, вызываемых различными инфекционными агентами, требует установления точного диагноза. Для решения этой проблемы все чаще применяют­ся современные методы молекулярной биологии. Так, к настоящему времени метод амплификации нуклеиновых кислот полимеразной цепной реакцией (ПЦР) уже достаточно широко используется в практической медицине как эффективный инструмент лабораторной диагностики [1, 2].

Применение ПЦР в диагностике заболеваний, передаваемых половым путем (ЗППП), в настоя­щее время получило наиболее широкое распространение. Этому способствовал ряд причин, важней­шими из которых были недостаточная эффективность применяемых ранее методов лабораторной ди­агностики (микроскопия, бактериальный посев, иммуноферментный анализ), быстрота выполнения ПЦР (в среднем 1 сутки), а также, до некоторой степени, относительная простота манипуляций с клиническим материалом. Первая зачастую объясняется особенностями биологии патогенных микро­организмов, таких как мелкие размеры и невозможность (или затруднительность) культивирования вне организма человека [3].

Указанные особенности характерны для Ureaplasma urealyticum — возбудителя одного из наи­более распространенных ЗППП [4]. В настоящее время по распространенности уреаплазмоз «сопер­ничает» с хламидийной инфекцией. И хотя уреаплазмы высеваются бактериологически, это занимает от 3 до 5 суток [5, 6].

Диагностика уреаплазмозов методом ПЦР осуществляется благодаря налаженному производству сертифицированных тест-систем. Наибольшим спросом и, соответственно, распространенностью в лабораторной практике в станах СНГ пользуются тест-системы российского производства (НПФ «Литех», «Амплисенс ТМ » ЦНИИЭ МЗ РФ, «Биоком», НПФ «ДНК-Технология» и др.). Не уступая по основным качественным характеристикам аналогам ведущих мировых производителей ПЦР тест-систем («Хоффман-Ла Рош», «Перкин-Элмер» и др.), продукция российских фирм выгодно отличает­ся в ценовом отношении, что, собственно, и является решающим фактором выбора.

Читайте также:  Как увеличить эстроген

Наиболее существенными характеристиками тест-систем для детекции ДНК патогенных микро­организмов являются чувствительность (способность обнаруживать наименьшие количества моле­кул-мишеней) и специфичность (способность реагировать только со специфическими последователь­ностями-мишенями) [7, 8]. К сожалению, рекламная информация фирм-изготовителей не всегда по­зволяет объективно оценить потребительские качества их продукции, тем более, что некоторые ха­рактеристики являются «know how» — а именно последовательности праймеров, а подчас и локали­зация последовательности-мишени.

Все сказанное обусловливает неизбежность и необходимость для практических лабораторий проводить систематическую исследовательскую работу по определению сравнительной эффективно­сти поступающих на рынок тест-систем.

Целью данного исследования была сравнительная характеристика эффективности тест-систем для амплификации ДНК патогенной бактерии Ureaplasma urealyticum производства «Амплисенс ТМ » ЦНИИЭ МЗ РФ (в дальнейшем — «Амплисенс») и компании «Биоком» (далее — «Биоком»).

Материалы и методы

Выделение ДНК из экспериментальных проб проводили с использованием наборов «ДНК-сорб А» и «ДНК-сорб B» («Амплисенс»), представляющих собой комплекты лизирующих и отмы-вочных растворов на основе детергентов и этилового спирта соответственно. Адсорбция ДНК осуще­ствляется на силикагелевом сорбенте.

Реакции амплификации ДНК осуществляли с использованием стандартных тест-систем фирмы «Амплисенс» и «Биоком» в режиме, рекомендованном фирмой-производителем.

Наборы для амплификации ДНК Ureaplasma urealyticum «Амплисенс» укомплектованы для применения технологии «горячего старта», который обеспечивается разделением праймеров, нуклео-тидов и Taq-полимеразы прослойкой воска. Расчетный объем реакционной смеси 25 мкл.

Наборы «Биоком» для амплификации ДНК Ureaplasma urealyticum представляют собой лиофи-лизированные концентрированные реакционные смеси (х2), расфасованные в 0,5 мл пробирки. Растворение лиофильного содержимого осуществляется добавлением специального раствора, постав­ляемого в комплекте (DNA-diluent). Расчетный объем реакционной смеси 20 мкл.

В качестве субстратов амплификации и, соответственно, молекул-мишеней использовали препа­рат ПКО (положительный контрольный образец) для U. urealyticum («Амплисенс»), содержавший 2,1 ГЭ/мл гена-мишени, а также образцы тотальной ДНК U. urealyticum из контрольной панели 7.

Электрофорез продуктов амплификации проводили с использованием наборов ЭФ-300 («Ампли-сенс»).

Результаты и обсуждение

В настоящей работе под специфичностью понимали узнавание идентичных молекулярных ми­шеней, что существенно отличается от понятия видовой специфичности тест-систем, позволяющей идентифицировать видовую принадлежность микроорганизма.

Исходной посылкой запланированных экспериментов являлось предположение о наличии по­следовательностей-мишеней для обеих изучаемых тест-систем в препарате «Положительный контрольный образец ДНК Ureaplasma urealyticum» (ПКО), представлявшем собой, согласно анали­тическому паспорту качества «Амплисенс», тотальную ДНК, выделенную из культуры уреаплазмы фенольным методом.

Целью экспериментов было выяснение степени идентичности используемых двумя фирмами-изготовителями последовательностей-мишеней.

Для этого был поставлен ряд реакций амплификации, в которых в качестве матрицы использова­ли препарат ПКО U. urealyticum в различных концентрациях (табл. 1).

Практически пробы были приготовлены последовательными разведениями с использованием буфера для разведения ДНК («Амплисенс»): 1: 95 мкл ТЕ + 5 мкл ПКО, 2: 50 мкл ТЕ + 50 мкл № 1, 3: 50 мкл ТЕ + 50 мкл № 2,

4: 50 мкл ТЕ + 50 мкл № 3.

Использование в качестве материала последовательных разведений имело целью определить одновременно степень чувствительности исследуемых тест-систем.

Было поставлено по 4 идентичных реакции каждой тест-системы. Условия проведения (поста­новка реакций, температурные режимы) соответствовали стандартам фирм-изготовителей.

Амплификацию проводили в аппарате с регулированием температур по матрице «Терцик-МС2», поэтому придерживались рекомендаций относительно температурного режима для аппаратов этого типа.

Последующий электрофорез продуктов амплификации обнаружил результаты, представленные на рисунке 1.

Анализ электрофореграммы показал отсутствие продуктов амплификации во всех пробирках с использованием тест-системы «Биоком». Неоднократное повторение эксперимента показало досто­верность полученных результатов и исключило возможность влияния производственного брака, кон­таминации или некорректной постановки реакций.

Читайте также:  Какие лекарства нельзя принимать беременным

Отсутствие накопления продуктов амплификации ПКО в реакциях с использованием тест-системы производства «Биоком» означает явное отличие ее специфичности от таковой у «Ампли-сенс». То есть в реакциях используются разные праймеры для амплификации последовательностей одного и того же гена либо амплифицируются последовательности разных генов, избранных в каче­стве характерной мишени. Сказанное носит вполне ожидаемый характер, если принять во внимание различный предсказанный размер ампликонов (756 п.н. у «Биоком» и 450 п.н. у «Амплисенс»).

Полученные результаты также позволяют сделать вывод о неполном соответствии свойств пре­парата ПКО U. urealyticum («Амплисенс»), заявленных в аналитическом паспорте качества. Вероятно, препарат представляет собой генно-инженерную конструкцию, содержащую искусственную после­довательность-мишень, фланкированную соответствующими праймерами, как это имеет место в пре­парате ВКО.

Таким образом, поставленные эксперименты показали явное различие в специфичности тест-систем для детекции ДНК U. urealyticum производства «Амплисенс» и «Биоком».

Результаты, полученные в предыдущих экспериментах, не позволяли использовать для точного определения чувствительности тест-систем препараты ПКО или ВКО («Амплисенс»). Вместе с тем названные работы требуют использования растворов матриц с заранее известной концентрацией.

Оптимальным субстратом могла бы быть культура U. urealyticum с известным титром клеток. В качестве замены таковой использовали три пробы из контрольной панели для оценки качества рабо­ты лабораторий («Амплисенс») U. urealyticum. Концентрации ДНК в них были подобраны с расчетом получения определенного количества ДНК гена-мишени (табл. 2).

Представленные пробы содержали только ДНК U. urealyticum.

Однако процедура использования контрольной панели предусматривает предварительное выде­ление ДНК из проб по стандартной методике «Амплисенс», что подразумевает неизбежные потери.

С целью определения порядка потерь ДНК в ходе процесса выделения молекул нуклеиновых ки­слот были проведены контрольные эксперименты.

Предварительно приготовленные разведения препарата ПКО (концентрации — аналогично табл. 1.) использовали в качестве исходного материала для выделения ДНК с помощью набора «ДНК-сорб А» («Амплисенс»). Полученные в результате образцы использовали для постановки серии реакций ам­плификации с помощью тест-системы U. urealyticum «Амплисенс». Параллельно ставили серию ре­акций с исходными растворами ПКО, не подвергшимися процедуре выделения.

Сравнительный анализ последующего электрофореза реакционных смесей обнаружил явные различия в эффективности амплификации ДНК ПКО. Фотография электрофореграммы амплифицированных фрагментов исходных ДНК и молекул, подвергшихся обработке комплектом реагентов «ДНК-сорб А», представлена на рисунке 2.

Визуальный анализ данной электрофореграммы позволяет оценить степень потерь ДНК при обработке набором «ДНК-сорб А», по меньшей мере, как двукратную.

С учетом полученных данных концентрации ДНК U. urealyticum контрольной панели (табл. 2) следует рассматривать следующим образом (табл. 3).

Обнаруженную закономерность полезно учитывать при интерпретации результатов анализов клинических проб в повседневной практике клинико-диагностических лабораторий, осуществляю­щих ПЦР-анализ.

Собственно эксперимент по определению чувствительности тест-систем «Амплисенс» и «Био-ком» был осуществлен постановкой параллельных рядов реакций амплификации ДНК проб кон­трольной панели U. urealyticum. Результаты эксперимента представлены в таблице 4 и на рисунке 3. Картину электрофореза, представленную на рисунке, обрабатывали компьютерной системой Totallab.

Полученные данные свидетельствуют о том, что чувствительность тест-системы «Биоком», как минимум, в два раза ниже, чем таковая тест-системы «Амплисенс».

Данные денситометрического анализа фотоснимка коррелируют с визуальными, приведенными в таблице 4.

Таким образом, получены экспериментальные данные, доказывающие, как минимум, двукратное превышение порога чувствительности тест-системы «Амплисенс» по сравнению с тест-системой «Биоком».

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Adblock detector