Содержание
С целью раннего выявления дифтерии и определения носителей дифтерийной палочки необходимы выделение и идентификация возбудителя, а также определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтеритические плёнки, слизь из носоглотки или отделяемое из подозрительных поражений кожных покровов.
Забор материала на дифтерию проводят двумя стерильными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через 3 ч.
Бактериоскопия дифтерийной палочки
Окраска по Граму не является специфичной, так как дифтерийные палочки сравнительно плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде палисада (параллельно) или в виде китайских иероглифов. Окраска по Найссеру позволяет выявить характерные зёрна Бабеша-Эрнста и отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки С. pseudodiphtheriticum (С. hofmannii), часто обитающей в носоглотке.
Культивирование дифтерийной палочки
Бактерии дифтерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом (например, Клауберга II или Маклёода), ложнодифтерийная палочка (палочка Хофманна) теллур не восстанавливает (см. рис. 8 на вклейке). Для выделения чистой культуры дифтерии часть подозрительной колонии засевают на скошенный агар (или среду Ру), вторую часть — на твёрдую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определение цистиназной активности (проба Пизу). При положительном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хйсса, пользуясь укороченным пёстрым рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатоген пых коринебактерии (рис. 14-3).
Для идентификации биоваров дифтерии используют «длинный» ряд углеводов, включающий крахмал и гликоген. Для полной идентификации можно исследовать способность бактерий расти в анаэробных условиях посевом уколом в столбик 0,5% сахарного агара (растёт только С. diphtheriae).
Определение токсигенности дифтерийной палочки
Определение токсигенности дифтерийной палочки in vivo. Проводят подкожным или внутрикожным заражением 0,5-1,0 мл бактериальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 ч до заражения одно животное иммунизируют дифтерийным антитоксином. При положительном результате неиммунизированные животные погибают в течение 3-5 сут.
Определение токсигенности дифтерийной палочки in vitro. Способность к образованию токсина можно определять заражением куриных эмбрионов или культур клеток с регистрацией последующего цитопатнческого эффекта. Можно использовать твердофазный ИФА с использованием антитоксинов, меченных пероксидазой. Также предложены ПЦР и ДНК-зонды для обнаружения гена tox в бактериальной хромосоме. Однако наибольшее распространение получил тест иммунодиффузии Илека. На среду с пониженным содержанием Fe2+ (для более интенсивного токсинообразования) проводят посев исследуемого изолята и эталонных токсигенного и нетокси-генного штаммов параллельными штрихами. На выросшие колонии накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифтерийным антитоксином. Образующийся токсин и антитоксин диффундируют в агар и в месте встречи образуют линии преципитации, так называемые «усы» или стрелы. На практике используют модификацию метода. Полоску бумаги, пропитанную антитоксином (500 ME в 1 мл), наносят на чашку, а исследуемые культуры засевают бляшками по обе стороны бумажной полоски. Контролем служит заведомо токсигенная культура, также посеянная «бляшкой». В результате встречной диффузии токсина и антитоксина в месте их контакта выпадает линия преципитации, сливающаяся с линией преципитации токсигенного штамма.
Фаготипирование дифтерийной палочки
Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 кори нефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis.
Реакция Райта
Развернутая РА для определении АТ при бруцеллезе
1. Сыворотка, разведенная в физрастворе двукратно (АТ)
2. Единый бруцеллезный диагностикум (АГ) (голубой, единственный подкрашенный)
Инкубация – 20 ч.
Механизм: при наличии АТ образуются хлопья агглютинации, оседающие на дно.
Титр АТ – наибольшее разведение, при котором еще есть агглютинация.
Реакция Манчини
Реакция преципитации в геле для определения уровня Ig – метод радиальной иммунодиффузии
Образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агарового геля, который содержит АТ против IgG, IgM или IgA в известной концентрации. Диффундирующие в агар Ig образуют кольца преципитации с антиглобулиновыми антителами, размер которых зависит от содержания в сыворотке Ig соответствующего класса. . По разведениям стандартной сыворотки строится калибровочная кривая, по которой определяется уровень Ig в исслед.сыворотке. Уровень сывороточных Ig отражает функциональное состояние B-системы организма.
Постановка ориентировочной РА для определения неизвестного микроба
Компоненты: 1. Взвесь неизвестной культуры в физ.р-ре (АГ в электролите)
2. Диагностические аггл. сыворотки (АТ): н-р, 1) поливалентная эшерихиозная 2) типовые О-26, О-55, О-111.
Механизм: при соответствии антигена антителу – хлопья агглютинации.
Окраска по Граму (чистая культура)
Позволяет выявить особенности строения КС бактерий
Стекло обезжирить мылом. Капля 0,9% NaCl. Культуру бакпетлей в каплю. Сушим. Фиксируем (3 раза провести над пламенем горелки). Генцианвиолет (бумажки по Синеву) смочить водой 1-2 мин. Р-р Люголя – 1-2 мин. Стряхиваем и краситель, и Люголь. Этиловый спирт – 30-60 с, до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя (опустить 3 раза). Промывание водой. Фуксин Пфейффера – 3-5 мин. промыть водой. Грам(+) не обесцвечиваются спиртом и сохраняют окраску певрого красителя (многослойный пептидогликан КС взаимодействует с краской и задерживает её в комплексе с йодом), грам(-) обеспечиваются спиртом и окрашиваются вторым красителем.
Окраска по Гинса-Бури
Позволяет выявить капсулу бактерий (называется негативным, так как капсула не прокрашивается)
В каплю черной туши внести культуру, смешать и 2 стеклом со шлифованным краем приготовить мазок, как из крови. Высушить. Зафиксировать на воздухе. Фуксин Пфейффера – 1-2 мин. Капсула не воспринимает красители, поэтому окрашиваем бактерии и окружающий фон. Фон окрашивается тушью в черный цвет, а возбудитель фуксином в розовый цвет, при этом капсула видна в виде светлого ободка вокруг бактерий.
Окраска по Ожешко
Позволяет окрасить споры бактерий.
На нефиусированный мазок 0,5% HCl – 3 мин с прогреванием (протрава). промывание водой (осторожно). Фиксация в пламени спиртовки. Окраска по Цилю-Нильсену. Спора, как кислотоустойчивая структура красится в красный цвет, а цитоплазма клетки, как кислотонеустойчивая структура – в синий цвет.
Окраска по Цилю-Нильсену
Позволяет определить кислотоустойчивые бактерии.
Карболвый фуксин Циля 3-5 мин. Промывание водой. 5% H2SO4 1-2 мин (для обесцвечивания). промывание водой. Метиленовая синь 3-5 мин. Промывание водой. Кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются после первого красителя, так как содержат больше липидов, воска, окислителей, поэтому окрашиваются в красный цвет. Кислотонеустойичвые бактерии и структуры обесцвечиваются после первого красителя, поэтому красятся в голубой цвет.
Тельца Бабеша-Негри
Цитоплазматические включения в нейронах (срезы аммонова рога и мозжечка), клетках слюнных желез при бешенстве – индикация вируса. Красные на голубом фоне.
Среда Эндо (диф.-диагн.) (МПА + 1% лактоза + осн.фуксин, обесцвеч. тиосульфитом натрия), Lac(+) – темно-красные колонии с металлич.блеском; для выявления энтеробактерий (сахаролитические свойства).
Среда Левина(диф.-диагн.) (МПА + 1% лактоза + метилен.синь и эозин), Lac (+) – насыщ. синего цвета; для выявления энтеробактерий (сахаролитические свойства).
Среда Плоскирева (диф.-электив.) (МПА + 1% лактоза + нейтр.красный + соли желч.к-т + бриллиант.зелен.) (для шигелл и сальмонелл); Lac (+) – красные.
Среда Раппопорта (желтая) (электив.-диф. для сальмонелл и шигелл) (МПБ + 1% желчь (электив.ф-р) + глю(диф.ф-р) + инд-р Андреде(кислый фуксин + NaOH): S.typhi –до кислоты (красный), S.paratyphi A,B – до кислоты и газа. Разливается в бутылки и колбы, т.к. в начале болезни сальмонеллы находятся в крови. Берут 5 мл крови и разбавляют в 10 раз (до 50 мл).
ЩПВ – щелочно-пептонная вода (селектив) (1% пептонная вода + 0,5% NaCl + KNO3 + Nа2CO3; pH = 9,0). Щелочь – селективный фактер для холерного вибриона.
Сахарный бульон (универсальная) (триптоза + мясной экстракт + глю + NaCl )
КА (диф-диаг) (агар+эритроцитарная масса). Для определения гемолизирующих свойств бактерий. Гемолиз: α – Hb превращается в гемосидерин (зеленый), β – просветы вокруг колоний, γ – отсутствие гемолиза.
ЖСА (элективн)(МПА + желточная взвесь + 10% NaCl). Для выявления фермента патогенности лецитовиттелазы (лецитиназы). (+) помутнение вокруг колоний.
МПБ (универсальная)(мясная вода + пептон + 0,5% NaCl).
Китта-Тароцци (для анаэробов) (сахарный бульон + кусочки паренхиматозных органов (для адсорбции О2) + высокий столбик + слой вазелинового масла (для изоляции от атмосферного воздуха). Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в теч 10-15 мин для удаления воздуха
Вильсона-Блера (железосульфитный агар) (3% МПА + 1% глю + 20% сульфит натрия + 8% FeCl3) Разливают высоким столбиком, сверху – вазелиновое масло (для изоляции от атмосферного воздуха). Позволяет выявить сероводородную активность. Анаэробы образуют колонии черного цвета за счет восстановления сульфита натрия, который, соединяясь с FeCl3 дает осадок сульфата железа черного цвета.
Игла –синтетическая (13 АМК, 7 витаминов, на основе сбалансированного солевого раствора Эрла). Питательный раствор для культур клеток, используемых для культивирования вирусов.
199 – синтетическая(20 АМК, 17 витаминов, глюкоза, минеральные соли, пурины и пиримидины – всего 199 компонентов, на основе сбалансированного солевого р-ра Хенкса). Питательный раствор для культур клеток, используемых для культивирования вирусов.
· хроническая гонорея – кровь / серологическое
· острая гонорея – гной / бактериоскопическое, бактериологическое
· дизентерия – испражнения / бактериологическое
· холера – испражнения / бактериологическое
· брюшной тиф – кровь, испражнения / бактериологическое, серологическое
· коклюш – отделения из носоглотки / бактериологическое
· дифтерия – пленки / бактериологическое
· сибирская язва – содержимое карбункулов / бактериологическое
· корь – кровь / серологическое
· полиомиелит – кровь, ликвор / серологическое
Определение токсигенности дифтерийной палочки реакцией преципитации в геле
В чашку Петри с питат.агаром кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Засевают исследуемые культуры, в качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. При размножении токисгенной культуры в месте соединения токсина с антитоксином в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий – «усов».
| | | следующая лекция ==> | |
| СВЕДЕНИЯ О РАБОТЕ, ВЫПОЛНЕННОЙ ВО ВРЕМЯ ПРАКТИКИ | | | Проект въездной группы в г.Тверь. |
Дата добавления: 2017-02-25 ; просмотров: 1719 | Нарушение авторских прав
В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или "усов".
Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.
Культуру засевают в виде "бляшек" диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 "бляшек". Из них 6 "бляшек" испытуемой культуры, 4-контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных "бляшек" и 4 – испытуемых. Чашки с посевом помещают в термостат при 37 град. C.
Результат учитывают через 18-24 часа и 48 часов роста. Следует иметь в виду, что препарат антитоксической противодифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийному антитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки. Поэтому при постановке пробы на токсигенность с использованием данного препарата преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты). Последние могут формироваться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Иногда отмечается появление множественных линий преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48-72 часа, в редких случаях могут появляться и на первые сутки. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18-24 часа от момента ее постановки. Если в течение данного времени у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции.
Варианты оценки результатов реакции:
- 1. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются токсигенными, если образуемые ими линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма.
- 2. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются нетоксигенными, если:
- а) линии преципитации, образуемые испытуемой культурой, отсутствуют, при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма;
- б) линии преципитации не могут слиться со специфическими линиями преципитации контрольного штамма, а скрещиваются или имеют тенденцию к скрещиванию с ними (неидентичные, неспецифические линии);
- в) линии преципитации испытуемой культуры сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма;
- г) линии преципитации испытуемой культуры перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма.
Очищенный ферментолизом и специфической сорбцией антитоксин не содержит антител к компонентам микробной клетки. При использовании этого препарата неспецифические линии преципитации не образуются.