Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются следующие живые объекты: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные.
I. Культуры клеток
Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на первичные (первично трипсинизированные), полуперевиваемые (диплоидные), перевиваемые, трансфецированные.
По происхождению они подразделяются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу — на фибробластные, эпителиальные и др.
Первичные культуры клеток — это клетки какой-либо ткани человека или животного, способные культивироваться в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности в специальной питательной среде, но не способные к длительному размножению. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.
Полуперевиваемые (диплоидные) культуры клеток — клетки одного генотипа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.
Перевиваемые клеточные линии характеризуются бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ — из сердца обезьяны циномольгус, ПЭС — из почек эмбриона свиньи, ВНК-21 — из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС — из почки морской свинки и др.), отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению в клетках таких свойств, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.
Другой источник перевиваемых клеточных линий — злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Получены и наиболее широко в вирусологической практике применяются следующие линии перевиваемых клеток: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Hep-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака легкого в костный мозг; RH — из опухоли почки человека.
Трансфецированные культуры клеток. Разработаны экспериментальные линии культур клеток методом трансфекции (переноса) генов вирусов, контролирующих биосинтез поверхностных антигенов. Такие культуры клеток экспрессируют поверхностный белок определенного вируса (HBs-антиген, gp120 и др.) на мембране клеток культуры. Такие культуры клеток используются с целью изучения иммунологических механизмов патогенеза вирусных инфекций, разработки химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов.
Для обеспечения жизнедеятельности культивируемых клеток необходимы питательные среды. По назначению они делятся на ростовые и поддерживающие. В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных веществ, обеспечивающих активное размножение клеток и формирование монослоя. Поддерживающие среды обеспечивают переживание клеток в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов.
Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред — сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит. С целью предотвращения возможного роста микроорганизмов в питательные среды вносят антибиотики.
Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Культура клеток– это клетки многоклеточных организмов (человека, животных), живущие и размножающиеся in vitro. Подразделяются на:
Ø первичные (неперевиваемые);
Первичные (неперевиваемые) культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов и тканей организма (почек, легких, кожи, тимуса, тестикул эмбриона человека или молодых животных).
Этапы приготовления первичных культур клеток:
Ø выделение органа/ткани;
Ø измельчение и гомогенизация ткани до частиц размером 2-4 мм;
Ø разъединение клеток путем трипсинизации;
Ø внесение в пробирку (флакон, матрас) с питательной средой (среда 199, Игла);
Ø инкубирование в термостате – клетки начинают делиться до покрытия поверхности стекла в один слой и прекращают размножаться (контактное торможение).
Первичные культуры клеток живут ≈ 7-21 день, при пересевах меняют форму и гибнут.
Полуперевиваемые культуры клеток – диплоидные клетки человека, выдерживающие до 50-100 пассажей (после перевивания в новую пробирку со свежей питательной средой вновь начинают размножаться до образования монослоя).
Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время (злокачественные/опухолевые клетки с гаплоидным набором хромосом, выдерживающие бесконечное количество пассажей): например, HeLa – клетки рака шейки матки (получены от женщины, умершей в 1956 г.), Нep-2 – клетки карциномы гортани и др.
Методы индикации вируса в культуре клеток:
1) цитопатическое действие (ЦПД) вируса на клетки – дегенеративные морфологические изменения клеток (мелкозернистое перерождение, округление, фрагментация, образование симпластов);
2) образование вирусом специфических внутриклеточных включений;
3) бляшкообразование (феномен Дальбекко) – образование в монослое клеток «стерильных пятен» (бляшек – деструктивные клетки, разрушенные вирусом и неспособные окрашиваться красителем нейтральным красным (количество бляшек соответствует количеству вирусных частиц);
4) цветная проба Солка – сохранение первоначального цвета среды (красного) при наличии вируса, тогда как активные незараженные вирусом клетки метаболизируют и изменяют цвет среды (желтый);
5) РГА с культуральной жидкостью;
6) реакция гемадсорбции (РГадс) – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженной вирусом клетки;
7) феномен интерференции (используется для обнаружения вирусов, не оказывающих ЦПД и не вызывающих гемагглютинацию) – в зараженную материалом культуру клеток вносят индикаторный вирус (ВВС – вирус везикулярного стоматита) с известным ЦПД (симпластобразование) – при наличии в культуре клеток исследуемого вируса индикаторный вирус ЦПД не окажет (клетка может поражаться только одним вирусом).
Достоинства – получение максимальной концентрации вируса.
Недостатки – не все вирусы культивируются в культуре клеток.
Культуры ткани – это клетки ткани выращенные вне организма на специальной питательной. среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен и восприимчивость к определенным вирусам. Для культивирования вирусов особенно пригодны клетки с быстрым ростом. По этой причине широко применяют эмбриональше ткани (фибробласты куриных эмбриовов, клетки человека к др., а также культуры тканей опухолей (клетки-Неla, Нер-2 и др.).
Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.
Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
Кулътивирование клеток может призойти в специальных флаконах (колбы-матрацы, флаконы Карреля) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую-либо опору, например, стенку пробирки.
В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста микрофлоры вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином.
О наличии и размножения вируса в клетках узнают по так называемому цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки гибнут, и под микроскопом заметны дегенеративные изменения клеток. Пласты зараженных клеток отслаиваются от стенки пробирки или флакона. Так как рост клеток прекращается, pН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса).
Питательной средой для культуры ткани могут быть различные растворы, сослав которых приближается к составу жидкости организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие).
9. Признаки размножения вирусов в курином яйце
Пока зателем заражения эмбриона вирусом может служить:
* его гибель в характерные для данного вируса сроки.
* патологоанатомические изменения, появляющие ся в различных структурах эмбриона.
Так, хорионаллантоисная оболочка (ХАО) может быть отеч ной, иметь кровоизлияния, узелки, или, как их называют, оспины(при заражении куриных эм брионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауески и некоторыми другими) При этом размер и морфология оспин заметно различаются при размножении разных вирусов. Сам зародыш может отставать в росте и разви тии от незараженных, т. е. проявлять феномен карликовости. Тело его может быть в разной степени обезвожено или мумифицирова но, шея характерно перекручена(инфекционный бронхит кур)
Встречаются вирусы (например, штамм В, вируса ньюкаслской болезни), которые, размножаясь в куриных эмбрионах, не вызывают ни их гибели, ни патологоанатомических изменений. Обнаружить такой вирус можно лишь в том случае, если он обладает способнос тью агглютинировать эритроциты, т. е. с помощью реакции гемагглютинации (РГА). Явление гемагглютинации представляет собой со единение эритроцитов в хлопья при добавлении к ним суспензии гемагглютинирующего вируса. Гемагглютинирующими свойствами обладают те вирусы, вирионы которых имеют на поверхности рецепто ры, способные взаимодействовать с рецепторами оболочек эритро цитов
Нередко при вскрытии эмбриона не удается обнаружить ни одного признака размножения вируса, хотя он и находится в ис следуемом материале. Такой пассаж, как уже говорилось, назы вается «слепым».
10. Методы обнаружения вируса в культуре к-к
1. Цитопатический эффект
2. Реакция гемадсорбции
3. Метод цветных проб
4. Метод бляшек
5. Иммунофлуоресцентный метод
6. Реакция связывания комплемента
7. Реакция гемаглютинации
8. Заражение животных, восприимчивых к данному вирусу
9. Реакция переципитации в агаре
11. Цитопатический эффект, определение, классификация
Это дегенерация к-к, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса.
Микроскопически выражается в различных изменениях морфологии к-к, образовании гигантских многоядерных к-к( симпластов), пикнозе ядер и в полной деструкции к-к.
Макроскопически заметно слущивание к-к со стенок пробирки. Х-р клеточной дегенерации зависит от вида вируса.
Может проявляться в виде след изменений :
1. Равномерная мелкозернистая деструкция к-к( полиовирусы, вирусы Коксаки)
2. Очаговая мелкозернистая дегенерация к-к( вирус гриппа,клещевого энцефалита)
3. Гроздевидная ( аденовирусы)
4. Крупнозернистая равномерная деструкция к-к( вирус герпеса)
5. Симпластообразование( респираторно-синуитиальный вирус, вирус кори)
12. Методы типирования вирусов
Определение типа вирусов в виртсодержащем материале основано на нейтрализации вируса типоспецифическими сыворотками. Конечный результат может быть установлен на основании след признаков:
1. Нейтрализация Цитопатического действия
2. Нейтрализация реакции гемадсорбции
3. Изменение, проявление цветной пробы.
4. Задержка реакции гемаглютинации
5. Нейтрализация в опытах на животных
6. Свечение к-к сод вирус, под влиянием типоспецифических флуоресцирующих сывороток.