Для бактериологического исследования на газовую гангрену берут экссудат, кусочки измененной ткани из раны больного, а также кровь из вены. Трупный материал следует брать по возможности быстрее после смерти, так как в ткани трупа могут проникать различные патогенные анаэробные микроорганизмы, всегда имеющиеся в желудочно-кишечном тракте. Все взятые материалы помещают в стерильную герметически закрывающуюся стеклянную посуду и немедленно пересылают в бактериологическую лабораторию. Все пробы подвергают микроскопии. Для этой цели готовят мазки-отпечатки и окрашивают их по Граму. Наличие в пробе большого количества крупных грамположительных палочек служит ориентировочным признаком для подозрения на клостридиальную инфекцию.
Бактериологическое исследование: плотные материалы стерильно измельчают, кровь или экссудат подвергают центрифугированию в течение 30 мин. Взвесь исследуемого материала засевают на кровяной агар, агар Вильсона-Блэра и бензидиновый агар. Посевы инкубируют в анаэробных условиях при 37 °С, просматривают на следующий день и затем через каждые 2 дня (до 7 суток) для выделения подозрительных колоний. Выраженные колонии, вызывающие гемолиз на кровяном агаре, проверяют на чистоту и наличие грамположительных палочек (путем микроскопии) и затем отсевают в пробирки с жидкой казеиново-грибной средой под слоем вазелинового масла либо на анаэробную среду Китта-Тароцци. Выделенные чистые культуры проверяют на токсичность и вирулентность, а также проводят биологическую пробу на лабораторных животных (мышах, морских свинках).
Вопрос 71.Возбудитель столбняка
1. Морфология, биология и культуральные свойства возбудителя столбняка
2. Токсины
3. Лабораторная диагностика столбняка
1.Столбняк — инфекция, возникающая после различных травм и ранений в связи с загрязнением ран почвой, содержащей столбнячную палочку(Clostridium tetani).
Морфология: возбудитель столбняка — это подвижная палочка 4—8 мкм в длину и 0,4—0,6 мкм в ширину с закругленными концами. Образует крупные споры, в результате этого приобретает вид барабанной палочки. Имеет жгутики, подвижна. Хорошо окрашивается всеми анилиновыми красками. По Граму красится положительно, но в старых культурах встречаются и грамотрицательные особи. Споры окрашиваются плохо. При окраске метиленовым синим или по Граму споры имеют вид колечек. Вегетативная форма бактерий столбняка малоустойчива к воздействию температуры и химических агентов, тогда как их споры обладают значительной устойчивостью. Во влажной среде споры выдерживают нагревание до 80 °С в течение 4—6 ч и более, при кипячении они погибают через 40—50 мин. В сухом состоянии споры переносят еще более высокие температуры* нагревание при 115 °С разрушает их только через 20 мин, споры совершенно нечувствительны к низким температурам. Они годами переносят температуру 40—60 °С, 1%-ный раствор сулемы или 5%-ный раствор карболовой кислоты убивают споры только через 10—12 ч. Под действием рассеянного света споры погибают только через длительное время. Будучи защищены от света, в почве и на различных предметах внешней среды споры могут сохраняться в течение десятков лет. В условиях анаэробиоза при температуре 37 "С, достаточной влажности и в присутствии аэробных бактерий (стафилококки, сенная палочка и др.) споры прорастают в развивающиеся вегетативные формы.
Биология, культуральные свойства: возбудитель столбняка — строгий анаэроб и очень чувствителен к кислороду. Микроб хорошо растет в глубине жидких питательных сред при наличии в них глюкозы, кусочков печени или мышц <среда Китта-Тароцци). Для культивирования столбнячной палочки применяют бульон Мартена (мясо-пептонный с добавлением глюкозы, подщелоченной раствором соды), среду Вейнберга (мясной агар).
Питательные среды должны иметь нейтральную или слабокислую реакцию. Жидкие среды заливаются слоем вазелинового масла, и перед посевом из них удаляют кислород путем кипячения на водяной бане в течение 10—15 мин. Оптимальная температура роста 35—37 °С. На плотных питательных средах — кровяном и печеночном агаре — столбнячная палочка растет только при полном удалении кислорода. На чашках с агаром при температуре 35—37 °С через 2—4 суток вырастают отдельные прозрачные или слегка сероватые колонии величиной 2—5 мм с неровной зернистой поверхностью, края шероховатые, ветвящиеся. На кровяном агаре колония бывает окружена зоной гемолиза. При почве на скошенном агаре в пробирках микроб растет в виде тонких, едва заметных нитевидных отростков, выползающих на поверхность агара. В столбике желатина через 5—6 дней растет в виде елочки, желатина при этом не разжижая. В биохимическом отношении возбудитель столбняка малоактивен, обладает слабовыраженными сахаролитическими и протео-литическими свойствами.
Антигенная структура: по антигенной структуре возбудитель столбняка неоднороден. Выделяют групповой соматический О-антиген и типоспецифический жгутиковый Н-антиген, по которому различают 10 серологических типов. Все они вырабатывают один и тот же специфический токсин.
2. Токсинообразование является важнейшей биологической особенностью вегетативной формы столбнячной палочки. Столбнячный токсин относится к экзотоксинам и состоит из 2 фракций:
• тетаноспазмина со свойствами нейротоксина, который поражает двигательные клетки центральной нервной системы и вызывает сокращение поперечно-полосатых мышц;
• тетаногемолизина, лизирующего эритроциты.
Экзотоксин является одним из сильнейших бактериальных ядов, уступая по силе лишь ботулиническому токсину. Токсин не содержит углеводов, относится к протеинам. Он малостоек, быстро разрушается под влиянием нагревания, солнечного света, щелочной среды. Ферменты и энзимы желудочно-кишечного тракта не разрушают токсин, но он не всасывается через слизистую оболочку кишечника, в связи с чем безопасен при попадании через рот. Под действием формалина и при содержании в термостате при 37—38 "С в течение суток токсин утрачивает ядовитые, но сохраняет антигенные свойства. Полученный таким образом столбнячный анатоксин используют для активной иммунизации против столбняка.
3. Лабораторная диагностика столбняка. Бактериологическое исследование: исследуется материал, взятый из раны:
• тампоны, закладываемые в рану при перевязке;
• перевязочный материал, содержащий выделения из раны;
• в случаях столбняка после родов или аборта берут на исследование выделения из влагалища и матки;
• при подозрении на столбняк у новорожденного исследованию подвергают выделения из пуповины;
• при исследовании трупа также берут материал из раны, если она имеется, из различных воспалительных очагов и старых рубцов.
В некоторых случаях столбняка происходит генерализация инфекции, возбудитель может быть обнаружен во внутренних органах. Поэтому берут на исследование от трупа кровь, кусочки печени и селезенки. Исследование материала производится с целью обнаружения в нем столбнячного токсина и возбудителя столбняка.
Обнаружение столбнячного токсина: исследуемый материал растирают в стерильной ступке, добавляют двойной объем физиологического раствора. Часть материала засевают в 2 флакона с жидкой питательной средой. Для постановки реакции нейтрализации на животных экстракт исследуемого материала вводят внутримышечно 2 мышам по 0,5 мл экстракта, а еще 2 мышам — те же дозы с противостолбнячной сывороткой. В зависимости от количества токсина симптомы столбняка у животных развиваются на 1-е или 2-е сутки. У животных, получивших токсин с противостолбнячной сывороткой, симптомы не появляются, что свидетельствует о наличии в исследуемом материале столбнячного токсина.
Одновременно с постановкой реакции нейтрализации производят посев растертого материала в 2 флакона или 2 пробирки с питательной средой <бульон Мартена, бульон Вейнберга) под слоем вазелинового масла. Перед посевом из среды удаляют кислород путем кипячения 15 мин, а затем охлаждают до 40— 50 °С и в нее добавляют 0,5% глюкозы. После культивирования при температуре 35 "С на 2, 4, 6 и 10-е сутки микроскопируют мазки из посевов и исследуют культуральную жидкость на наличие столбнячного токсина. Для этого ставят реакцию нейтрализации с противостолбнячной сывороткой. При обнаружении в посеве столбнячного токсина и наличии грамположительных палочек с крупными спорами дают положительный ответ.
Вопрос 72.Морфология и биология возбудителя сибирской язвы
Материалом для исследования являются: отделяемое раны, фрагменты пораженных органов и тканей, перевязочный и шовный материал и т.д.
Ускоренный метод диагностики – газожидкостная хроматография. По спектру выделяемых жирных кислот (бутират и др.) способ позволяет быстро подтвердить наличие анаэробной инфекции в материале.
Наличие экзотоксинов в фильтрате исследуемого материала определяют в реакции преципитации, ИФА, РПГА. Для быстрого обнаружения экзотоксина в крови больного ставят РПГА с эритроцитарным поливалентным антитоксическим диагностикумом или ИФА.
Микроскопический метод: кроме окрашенных по Граму мазков-отпечатков из ран, используется прямой метод иммунной флюоресценции с применением специфических люминесцирующих сывороток.
Бактериологический метод – измельченные ткани или отделяемое ран засевают на анаэробный кровяной агар, среду Вильсон-Блера, Китта-Тароцци.
Посевы помещают в анаэростат и термостат, возбудителя идентифицируют по морфологическим, культуральным, биохимическим и токсигенным свойствам.
Обнаружение C. perfringens проводят по быстрому, в течение 3-х часов, почернению железосульфитной среды Вильсон-Блера и раннему (в течение 5-6 часов) створаживанию молока (среда Тукаева).
Быстрое определение C. novyi проводят с помощью бензидинового теста, для чего колонии, выросшие в анаэростате на глюкозо-кровяном агаре с бензидином, держат на воздухе. В условиях аэрации они быстро чернеют.
C. hystolyticum активно расплавляют кусочки ткани в среде Китта-Тароцци.
В реакции нейтрализации на мышах используют специфические противогангренозные сыворотки. Учет проводят по выживаемости животных.
Лечение газовой гангрены комплексное и включает тщательную хирургическую обработку ран, дезинтоксикационную инфузионную терапию, назначение антибиотиков (β-лактамов, аминогликозидов), которые подавляют рост анаэробов и сопутствующей микрофлоры.
При тяжелых интоксикациях возможно применение противогангренозных поливалентных антитоксических сывороток или иммуноглобулинов против наиболее частых видов возбудителей (C. perfringens, C. novyi, C. septicum), однако их активность снижается в условиях нарушенного кровообращения в пораженных тканях.
Профилактика заболевания неспецифическая. Анатоксин против газовой гангрены существенно менее эффективен, чем анатоксины столбняка либо дифтерии в профилактике соответствующих болезней. Предупреждение инфекции возможно при адекватном хирургическом лечении пациентов и назначении антибиотиков, активных в отношении клостридий.
Возбудители столбняка
Возбудители столбняка относятся к виду Clostridium tetani. Они были впервые обнаружены в 1883 г. Н. Д. Монастырским и в 1884 г. А. Николайером, в чистой культуре выделены С. Китазато в 1889 г.
Возбудитель – грамположительная прямая крупная палочка с перитрихиальными жгутиками (около 20), подвижная, имеет круглые споры, превышающие диаметр клетки и расположенные у полюса, поэтому возбудитель имеет вид барабанной палочки.
Строгий анаэроб, хемоорганотроф. Способен к росту в температурном диапазоне 14-45°С. Культивируется в анаэробных условиях, на среде Китта-Тароцци вызывает помутнение, на кровяном анаэробном агаре образует отростчатые колонии с гемолизом, на сахарном агаре – чечевицеобразные колонии.
Клостридии столбняка не ферментируют углеводы. Разлагают желатин, коагулируют молоко, индол не образуют, восстанавливают нитраты в нитриты.
C. tetani имеют О- и Н-антигены, по Н-антигенам дифференцируются на 10 сероваров.
C. tetani образует сильнейший экзотоксин, который уступает по летальному эффекту только экзотоксину возбудителя ботулизма. Смертельная доза для человека составляет 2-2,5 нг/кг массы тела.
Он состоит из двух фракций: тетаноспазмина (нейротоксина) и тетанолизина (разрушает мембраны клеток, включая эритроциты).
Тетаноспазмин – полипептид молекулярной массой 150 000 Da. По биохимическому механизму действия представляет Zn-металлопротеазу.
Данный токсин разрушает нейробелки пресинаптических мембран преимущественно во вставочных нейронах ЦНС. Нарушается высвобождение их медиаторов. В результате тетаноспазмин блокирует тормозное действие вставочных нейронов на мотонейроны. Вследствие этого возникающие в мотонейронах импульсы беспрерывно поступают к мышцам, вызывая их сокращение.
Продукция тетаноспазмина кодируется плазмидными генами, отсюда разные штаммы возбудителя значительно отличаются по вирулентности.
Тетанолизин – мембранотропный токсин, разрушает эритроциты, обладает гемолитическим и кардиотоксическим действием. Способен поражать также вегетативную нервную систему и ядра продолговатого мозга, что может вызывать метаболические нарушения, гемодинамические расстройства, приводить к отеку мозга, некрозу в мышцах. Тем не менее, тетанолизин играет только вспомогательную роль в патогенезе столбняка.
В культурах клостридий токсин появляется на вторые сутки с пиком продукции к 5-7 дню. Разрушается при длительном хранении в термостате под воздействием света и кислорода, протеолитических ферментов.
Благодаря наличию спор, возбудитель устойчив во внешней среде, в почве сохраняется более 10 лет, при кипячении погибает в течение 50-60 минут, 1% раствор формалина и 5% раствор фенола уничтожают их через 12 часов.
Дата добавления: 2016-11-24 ; просмотров: 897 | Нарушение авторских прав
Раневую анаэробную инфекцию у человека вызывают как спорообразующие анаэробные бактерии (Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium histolyticum), так и неспорообразующие анаэробные микроорганизмы родов Bacteroides, Peptococcus, Peptostreptococcus, Veilonella и др.
Методы микробиологических исследований при анаэробной инфекции представлены в схеме 3.
Бактериоскопический метод. Проводится микроскопия окрашенных по Граму, Цилю-Нильсену и Гинсу-Бурри мазков, приготовленных из раневого отделяемого, отечной жидкости, некротизированной ткани. Обнаружение в препаратах крупных прямых грамположительных палочек, образующих капсулы и центрально или субтерминально расположенные споры (рис. 3), дает основание поставить предварительный диагноз газовой гангрены. Для экспресс-диагностики применяют прямой метод иммунофлюоресценции.
| Схема 3. Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций | |
| Материал: кусочки некротизированных тканей, экссудат, гной, отделяемое ран, кровь, секционный материал. | |
| Микроскопический метод. Микроскопия окрашенных по Граму, Цилю-Нильсену и Гинсу-Бурри мазков, приготовленных из материала от больного с целью обнаружения крупных грамположительных палочек, образующих капсулы и центрально или субтерминально расположенные споры Биопроба Заражение морских свинок материалом от больного в смеси с антитоксическими сыворотками против различных видов клостридий (РН) или без них. Гибель контрольной морской свинки через 30 минут – 4 часа. В РН выживает одна морская свинка, у которой токсин нейтрализуется соответствующим видом сыворотки. Бактериологический метод. 1. день. Посев исследуемого материалана среды Цейсслера (анаэробный кровяной | МПА), Китт-Тароцци, железо-сульфитный агар (ЖСА) и молоко (образование через 3-4 часа губкообразного сгустка, погруженного в прозрачную жидкость). 2 день –учет роста(помутнение и образование газа на среде Китт-Тароцци; черные в виде чечевичек, дисков, комочков ваты колонии в глубине ЖCA; шероховатые, крупные, плоские сероватые колонии с зоной гемолиза на среде Цейсслера). Пересев на среду Китт-Тароцци для выделения чистой культуры. 3 день – Проверка чистоты выделенной культуры, пересев на среды «пестрого» ряда с целью определения биохимических свойств, выявление токсинов (биопроба) и факторов патогенности с целью идентификации выделенной культуры анаэробов. 4 день.Заключение о виде выделенной культуры анаэробов. |
Бактериологический метод.Производят посев исследуемого материалана среды Цейсслера (анаэробный кровяной МПА), Китт-Тароцци, железо-сульфитный агар (ЖСА) и молоко. В молоке через 3-4 часа образуется губкообразный сгусток, погруженный в прозрачную жидкость. На среде Китт-Тароцци через сутки регистрируется помутнение и образование газа, на ЖCA – черные колонии в глубине агарового столбика, на среде Цейсслера – шероховатые (реже – гладкие), крупные, плоские сероватые колонии с зоной гемолиза. В глубине плотных питательных сред образуются колонии в виде чечевичек, дисков, комочков ваты и т.д. В мазках из колоний обнаруживают крупные грамположительные палочки (рис. 5). Для выделения чистой культуры возбудителей газовой гангрены типичные колонии пересевают на среду Китт-Тароцци и идентифицируют до вида в соответствии с таблицами 4 и 5.
 |
 |
| Рис. 4. Возбудитель газовой гангрены (Clostridium perfringens) в материале от больного. Окраскапо Граму. х 900 | Рис. 5. Возбудитель газовой гангрены. Чистая суточная культура Clostridium perfringens. Окраскапо Граму. х 900 |
Таблица 4. Биологические свойства неспорообразующих и спорообразующих анаэробов
| Свойства | Бактерии | ||||||||
| Peptococcus | Peptostreptococcus | Veilonella | Bacteroides | C.perfringens | C.novy | C.septicum | C.sordelli | C.histolyticum | |
| Морфология | кокки | кокки | кокки | палочки | палочки | палочки | палочки | палочки | палочки |
| Подвижность | – | – | – | ± | – | + | + | + | + |
| Споры | – | – | – | – | + | + | + | + | + |
| Окраска по Граму | + | + | – | – | + | + | + | + | + |
| Ферментация углеводов | + | + | – | + | + | + | + | + | – |
| Свертывание молока | – | – | + | + | + | v | – | + | + |
| Продукция H2S | + | – | + | ± | – | – | – | v | v |
| Продукция индола | – | – | – | ± | – | – | – | – | – |
| Разжижение желатины | – | – | – | ± | + | + | + | + | + |
| Редукция нитратов | ± | – | + | ± | ± | ± | ± | – | – |
| Гемолиз эритроцитов | – | – | ± | + | + | + | + | + | |
| Образование токсина | – | – | – | – | + | + | + | + | + |
Обозначения:(+) – постоянный признак, (±) – непостоянный признак, (-) – отсутствие признака, V- вариабельный признак
Таблица 5.Биологические свойства основных возбудителей газовой гангрены и столбняка
| Виды клостридий | Капсула | Подвижность | Лецитиназа | Индол | Ферментация | ||
| лактозы | сахарозы | маннита | |||||
| Clostridium perfringens | + | – | + | – | + | + | + |
| Clostridium Novy | – | + | + | – | – | – | – |
| Clostridium septicum | – | + | _ | – | + | – | – |
| Clostridium Tetani | – | + | _ | + | – | – | – |
Обозначения:(+) – постоянный признак, (-) – отсутствие признака,
Определение лецитиназной активности. Положительная реакция на лецитиназу проявляется в виде помутнения взвеси лецитина. При отрицательной реакции, которая наблюдается при нейтрализации фермента соответствующей антисывороткой, жидкость остается прозрачной.
Окончательную идентификацию выделенных клостридий газовой гангрены проводят с помощью биопробы (см. ниже) путем постановки реакции нейтрализации с поливалентными и моновалентными сыворотками для выявления и типирования экзотоксинов клостридий.
Биопроба. Смесь исследуемого материала с моновалентными антитоксическими сыворотками против различных видов клостридий вводят подкожно морским свинкам. Контролем служит морская свинка, которой вводят исследуемый материал без сывороток. При наличии токсина контрольная морская свинка погибает через 30 минут – 4 часа после инъекции материала. В опытах нейтрализации токсина антитоксическими сыворотками выживает одна морская свинка, при этом вид сыворотки соответствует виду токсина.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9310 – 
| 7287 – 
или читать все.
78.85.4.207 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно