| Приоритеты: |
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии. Предложен аллерген нейссерия перфлава, представляющий собой смесь инактивированных фенолом микробных клеток штаммов "57", "11" и продуктов их метаболизма с концентрацией 300-500 млн микробных клеток/мл, рН 6,5-7,3. Данный аллерген может быть использован для специфической диагностики к нейссерии перфлава и в способах иммунотерапии больных инфекционно-аллергическими заболеваниями. Техническим результатом является диагностика чувствительности к нейссерии перфлава и проведение специфической иммунотерапии. 3 с.п. ф-лы, 4 табл.
Рисунки к патенту РФ 2183969
Изобретение относится к области медицины, а именно иммунологии, и касается создания препарата для диагностики чувствительности к нейссерии перфлава и способа иммунотерапии.
В патентной литературе аллергена нейссерии перфлава не обнаружено.
Задачей настоящего изобретения является получение аллергена нейссерия перфлава для диагностики чувствительности к нейссерии перфлава и специфической иммунотерапии.
Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.
Аллерген нейссерия перфлава представляет собой смесь инактивированных фенолом микробных клеток штаммов "57", "11" и продуктов их метаболизма с концентрацией 300 – 500 млн микробных клеток/мл, pH 6,5 – 7,3.
Аллерген нейссерии перфлава может быть использован для специфической диагностики повышенной чувствительности к нейссерии перфлава, при этом аллерген вводят внутрикожно в объеме 0,05 мл в среднюю треть ладонной поверхности предплечья с последующей оценкой реакции кожи на введение аллергена через 20 минут и 24 часа.
Способ иммунотерапии больных инфекционно-аллергическими заболеваниями осуществляется путем введения аллергена нейссерия перфлава путем подкожных инъекций в постепенно возрастающих дозах с интервалом между инъекциями 3 – 5 дней.
Для изготовления аллергена использованы штаммы "57", "11" вида Neisseria perflava, депонированные в коллекции музея живых культур ГНСК им. Л.А. Тарасевича ( 080230 и 080232).
Аллерген представляет собой прозрачную или слегка опалесцирующую, бесцветную или окрашенную жидкость, в которой возможно наличие взвеси конгломератов инактивированных микробных клеток.
Концентрация микробных клеток составляет 300 – 500 млн/мл; белковый азот не более 3000 PNU/мл. Препарат стерильный, апирогенный. Пирогенность препарата определялась введением внутривенно тест-дозы 250000 микробных клеток/мл на 1 кг массы кролика.
Препарат нетоксичный. Токсичность определялась не белых мышах массой 18-20 г путем внутрибрюшинного введения 0,5
0,1 мл препарата.
Для специфической диагностики аллерген вводят внутрикожно в объеме 0,05 мл в среднюю треть ладонной поверхности предплечья, обработанную 70 o этиловым спиртом. Одновременно в качестве контроля вводят внутрикожно 0,05 мл разводящей жидкости (последняя используется в качестве тест-контрольной жидкости). Реакция на разводящую (тест-контрольную) жидкость должна быть отрицательной, при положительной реакции на разводящую жидкость реакцию на аллерген не учитывают.
Перед постановкой кожной пробы с аллергеном для определения реактивности кожи вводят внутрикожно 0,01%-ный раствор гистамина в объеме 0,02 мл, который готовят путем разведения гистамина-дигидрохлорида (1 часть) 0,9%-ным раствором натрия хлорида изотонического для инъекций (9 частей). Реакция кожи на гистамин должна быть положительной, при отрицательной реакции на гистамин аллерген не вводят.
Аллерген, разводящую жидкость, 0,01%-ный раствор гистамина набирают с соблюдением правил асептики в стерильные шприцы вместимостью 1,0 мл с делениями на 0,1 мл стерильными иглами путем прокола резиновой пробки флакона, предварительно обработанной 70 o этиловым спиртом. Шприцы и иглы должны быть индивидуальными для каждого препарата и больного.
У лиц, имеющих повышенную чувствительность к нейссерии перфлава, в месте введения препарата развивается реакция кожи в виде волдыря или инфильтрата и гиперемии.
Реакцию кожи учитывают через 20 минут (реакции немедленного типа) и через 24 часа (реакции замедленного типа) и регистрируют согласно прилагаемым схемам.
Критерием оценки положительной кожной реакции служит размер волдыря или инфильтрата.
Схема учета кожной реакции через 20 минут приведена в табл.1.
Схема учета кожной реакции через 24 часа приведена в табл. 2.
Специфическую иммунотерапию (СИТ) проводят путем подкожных инъекций различных разведений аллергена в постепенно возрастающих дозах.
Для приготовления лечебных разведений аллерген последовательно десятикратно разводят разводящей жидкостью по следующей схеме:
1 разведение 1:10 (10 -1 )
2 разведение 1:100 (10 -2 )
3 разведение 1:1000 (10 -3 )
4 разведение 1:10000 (10 -4 )
5 разведение 1:100000 (10 -5 )
6 разведение 1:1000000 (10 -6 )
Для этого берут 6 маркированных флаконов, содержащих по 4,5 мл разводящей жидкости. В первый флакон вносят стерильным шприцем при соблюдении условий асептики 0,5 мл аллергена. Этот флакон будет соответствовать разведению 1: 10 (10 -1 ). После тщательного перемешивания из первого флакона другим стерильным шприцем 0,5 мл смеси переносят во второй флакон, вновь перемешивают, затем 0,5 мл смеси из второго флакона переносят в третий и так последовательно до флакона 6 (каждый раз новым шприцем).
Разведенные аллергены хранят при температуре (+4) – (+8) o C не более месяца.
До начала проведения специфического лечения определяют пороговую чувствительность к аллергену. Для этого на ладонной поверхности предплечья одновременно ставят внутрикожно 3-4 пробы с разведением аллергена 10 -6 , 10 -5 , 10 -4 в дозе 0,1 мл. При наличии положительных реакций начальной лечебной дозой считается наибольшее разведение аллергена, которое дает сомнительную или отрицательную кожную реакцию. В том случае, если повышенная чувствительность отсутствует, лечение можно начинать с больших концентраций аллергена (10 -3 или 10 -2 ).
В дальнейшем повышение доз аллергена производят индивидуально в зависимости от переносимости больным препарата.
Интервалы между инъекциями составляют 3 дня, а в разведении 10 -2 и 10 -1 – 5 дней.
Инъекции проводят подкожно в области предплечья или плеча в дозе от 0,1 до 0,7-1,0 мл (от 4 до 10 инъекций каждого разведения). Первые 2-3 инъекции могут сопровождаться возникновением не резко выраженной реакции в виде усиления кашля, ринита и других симптомов основного заболевания, что не является препятствием продолжения лечения.
При наличии более выраженной реакции следующую инъекцию аллергена пропускают. В дальнейшем лечение продолжают с дозы на один-два порядка ниже той, при которой возникла реакция обострения.
Схема специфической иммунотерапии аллергеном нейссерия перфлава приведена в табл.3/
Курс СИТ продолжается от четырех до шести месяцев, может быть сокращен до 3-5 месяцев, после чего назначают поддерживающую терапию, которую больной может получать 1-3 года. Инъекции аллергена в разведении 1:10 в дозе 1 мл проводят в течение 1-3 лет, из них первые 6 месяцев с интервалом 2 недели и в последующем – 1 раз в месяц. В тех случаях, когда больной плохо переносит большие дозы аллергена, в качестве поддерживающей дозы используют дозу, переносимую больным. В процессе лечения проводят исследование крови 1 раз в месяц.
Аллерген нейссерия перфлава выпускают в комплекте, включающем 1 флакон с аллергеном (2,0 мл) и 9 флаконов с разводящей жидкостью (4,5 мл). Срок годности аллергена 2 года. Аллерген хранят в темном помещении с относительной влажностью воздуха не более 60% при температуре (62) o C.
Аллерген нейссерия перфлава разрешен к применению в медицинской практике Министерством здравоохранения РФ.
Производственные штаммы микроорганизмов.
Характеристика производственных штаммов микроорганизмов приведена в табл.4.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Аллерген нейссерия перфлава, представляющий собой смесь инактивированных фенолом микробных клеток штаммов "57", "11" и продуктов их метаболима с концентрацией 300-500 млн микробных клеток/мл, рН 6,5-7,3.
2. Способ диагностики чувствительности к нейссерии перфлава, характеризующийся тем, что аллерген нейссерии перфлава по п. 1 вводят внутрикожно в объеме 0,05 мл в среднюю треть ладонной поверхности предплечья с последующей оценкой реакции кожи на введение аллергена через 20 мин и 24 ч.
3. Способ иммунотерапии больных инфекционно-аллергическими заболеваниями, характеризующийся введением аллергена нейссерии перфлава по п. 1, при этом аллерген вводят путем подкожных инъекций в постепенно возрастающих дозах с интервалом между инъекциями 3-5 сут.
NEISSERIA (Neisseria Trevisan 1885) — род кокковидных грамотрицательных бактерий семейства Neisseriaceae, Prevot 1933. Бактерии рода N.— аэробные или факультативноанаэробные кокки, у к-рых одна сторона вогнута, как у боба; располагаются обычно попарно, вогнутой стороной друг к другу, грамотрицательны. Нек-рые виды плохо растут на обычных питательных средах, но хорошо размножаются на сывороточных средах или средах с добавлением крови. Для N. характерна цитохромоксидазиая и каталазная активность.
Род N. по классификации Берджи (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1974) включает в себя следующие виды: N. gonorrhoeae — гонококк — возбудитель гонореи (см.), N. meningitidis — менингококк — возбудитель менингита (см.); не патогенны N. sicca, N. subfla-va, N. flavescens, N. mucosa. N. flavescens иногда патогенен для людей (большинство штаммов, по-видимому, патогенно для мышей), серо-логически связан с N. sicca. Входивший ранее в этот род N. catarrhalis отнесен в род Branhamella и название изменено на Branhamella catarrhalis.
Neisseria sicca (von Lingelsheim 1908), Bergey et al. 1923 (Diplococcus pharyngis siccus, von Lingelsheim 1906, Diplococcus siccus von Lingelsheim 1903) описан в 1906 г. Лингель-схеймом (W. von Lingelsheim), выделен из слизи носоглотки. Кокки, расположенные поодиночке или парами (диплококки), мельче менингококков, иногда инкапсулированы, хорошо растут на простом агаре. Колонии неправильной округлой формы, непрозрачные, возвышающиеся над поверхностью среды, на кровяном агаре — сероватые, иногда сухие, крошатся при попытке снятия. На асцит-агаре колонии мелкие, 3 мм в диаметре, сероватые или слегка желтоватые, сухие морщинистые, с трудом снимающиеся со среды. Нек-рые штаммы образуют пигмент ксантофил. В изотоническом р-ре хлорида натрия N. sicca спонтанно агглютинируют. Разлагают левулезу, мальтозу без образования газа, Не ферментируют галактозу, лактозу, инулин, маннит, дульцит. Расщепляют сахарозу, Факультативные анаэробы. Оптимальная температура роста 36—38°.
Neisseria subflava (Flugge 1886), Trevisan 1889 (Micrococcus subflavus Fliigge 1886; Neisseria fiava, Bergey et al. 1923). По внешнему виду кокков, окраске по Граму, сахаролити-ческим свойствам и по образованию зеленовато-желтого пигмента N. subflava, N. flava и N. perflava объединены в один вид. Обнаруживают на слизистой оболочке дыхательных путей; иногда в цереброспинальной жидкости при менингите (X. Ногучи, 1963). Ферментирует декстрозу и мальтозу без образования газа, не разлагает левулезу, сахарозу, лактозу, галактозу, инулин, маннит и дульцит, факультативный аэроб. Гемолиза не дает. Желатины не разжижает. Сероводород и индол не образует. Оптимум роста при t° 37°; при t° 24° растет не всегда. Часто агглютинирует в изотоническом р-ре хлорида натрия.
Neisseria flavescens, Branham 1930 выделен из цереброспинальной жидкости больного эпидемическим цереброспинальным менингитом. Крупные кокки, располагающиеся парами; часты гигантские формы. На агаре с декстрозой растет плохо, хорошо растет на агаре с кровью и на полужидком агаре. Колонии мелкие суховатые, золотисто-желтые. Не разлагает декстрозу, левулезу, мальтозу и сахарозу. Факультативный аэроб. Оптимальная температура роста 37°. Neisseria mucosa Veron et al. 1959, выделен Лингельсхеймом в 1906 г. из носоглотки и цереброспинальной жидкости у больного с пневмонией и явлениями менингита. Кокки имеют капсулу или находятся в массе, окруженной липким слоем. Растет на простых средах, однако лучше на средах с добавлением сыворотки крови или асцитической жидкости; при этих условиях образуется больше слизистого слоя. Оптимум роста при t° 30—37°, отдельные штаммы растут при t° 42°; при t° ниже 22° роста нет. Желатину не разжижает, редуцирует нитрат и нитрит до газа и ферментирует глюкозу, мальтозу, фруктозу, сахарозу. На агаре колонии 1,5—4 мм в диаметре, круглые, слегка сливающиеся, сероватые, слизистые. Верон (М. Veron) с соавт. (1959) описал слегка желтый штамм. Не дает равномерной взвеси при смешивании в изотоническом р-ре хлорида натрия.
Ввиду ограниченных возможностей лаб. методов, применяемых для видовой дифференциации, а также разнообразия и непостоянства свойств N., таксономическое положение ряда видов не патогенных N. остается неясным и постоянно меняется. Так, положение ряда Neisseria (N. animalis, N. canis, N. caviae, N. cinerea, N. cuniculi, N. denitrificans, N. elongata, N. ovis, N. suis) в классификационной таблице Берджи (1974) еще не определено. Нет также общепризнанных различий штаммов N. gonorrhoeae по антигенным свойствам из-за большого количества различных серологических вариантов (сероваров).
Библиогр.: Андреева З.М. и Немировская Т. И. К систематике Нейссерия, Журн, микр., эпид, и иммун., № 1? с. 16, 1977; Красильников Н. А. Определитель бактерий и актиномицетов, с. 250, 295, М.— Л., 1949; Bergey’s manual of determinative bacteriology, ed. by R. E. Buchanan a. N. E. Gibbons, Baltimore, 1974; G or d o n J. Е» The gram-negative cocci in «colds» and influenza, J. infect. Dis., v. 29, p. 462, 1921; Kin s-Dury D. T. Deoxyribonucleic acid homologies among species of the genus Neisseria, J. Bact., v. 94, p. 870, 1967; Wilson G. S. a. Miles A. Topley and Wilson’s principles of bacteriology, virology and immunity, v. 1 — 2, L., 1975.
Нейссерии (Neisseria) — род грамотрицательных бактерий, включающий в себя как целый ряд видов — комменсалов, обитающих на слизистых оболочках человека, так и возбудителей серьёзных заболеваний, в частности, гонореи (Neisseria gonorrhoeae) и менингита (Neisseria meningitidis). Традиционно Neisseria gonorrhoeae может называться гонококком, Neisseria meningitidis — менингококком.