Лабораторная диагностика листериоза

Листериоз является инфекционным заболеванием, которое вызывает самые вирулентные пищевые инфекции. Листериоз распространен среди животных и людей. Характеризуется множеством источников инфекции, разнообразными путями и факторами ее передачи, множественными формами проявления и высокой летальностью. Листериозом в мире заболевает тысячи человек, от 20 до 30% из которых умирает. Смертность от тяжелых распространенных форм заболевания достигает 90 — 100%. Своевременная диагностика листериоза позволяет назначить адекватное лечение что, обеспечивает больному полное излечение.

Рис. 1. На фото больной с листериозным менингитом.

Полиморфизм клинических проявлений и невозможность выявления в ряде случаев источника инфекции создает исключительные трудности при установлении диагноза по клинико-эпидемиологическим данным. В связи с этим решающее значение приобретает лабораторная диагностика листериоза. Предварительный диагноз устанавливается на основании бактериоскопического исследования, окончательный диагноз требует бактериологического подтверждения или ПЦР.

Для исследования используются:

• Образцы крови, носоглоточная слизь, отделяемое из глаз, пунктат из лимфатических узлов, фекалии.
• У женщин, родивших мертвого ребенка или с признаками листериоза исследованию подлежат плацента, околоплодные воды, отделяемое родовых путей.
• У новорожденных исследуется меконий.
• У больных с подозрением на листериозный менингит исследуется спиномозговая жидкость.
• От трупов берется разнообразный биологический материал.
• Фекалии и мазки из ротоглотки берутся для установления бактерионосительства.

Диагностика листериоза с помощью простой и люминесцентной микроскопии

Рис. 2. Вид листерий под микроскопом. Бактерии располагаются поодиночке или парами, реже — короткими цепочками. При окраске по Граму листерии окрашиваются в розовый цвет.

Рис. 3. Листерии в свете микроскопа, дающего трехмерное увеличение, выглядят как цилиндры.

Рис. 4. Листерии в макрофагах.

Микроскопия листериозных гранулем

Снижение работы клеточного иммунитета приводит к распространению инфекции по всему организму. В органах и тканях образуются специфические гранулемы — листериомы. Их специфический состав определяется при микроскопировании мазка или биопата.

Рис. 5. Гранулемы в печени (фото слева). Гранулема (листериомы) в головном мозге (фото справа).

Лабораторная диагностика листериоза с помощью бактериологического исследования

Листерии растут при комнатной температуре на обычных питательных средах — слабощелочных и нейтральных. Посевы рекомендуется делать в первые 7 — 10 суток заболевания. Инкубация продолжается 3 недели при температуре 37 °С. При посеве на глюкозно-кровяной агар отбирают типичные колонии (прозрачные или роговидные), дающие гемолиз.

Рис. 6. Колонии листерий при посеве на мясопептонном агаре напоминают капельки росы. В проходящем свете колонии приобретают перламутровый оттенок.

Рис. 7. При росте листерий на хромогенном агаре колонии приобретают синюю окраску.

Рис. 8. При росте на оксфордском агаре вокруг колоний образуется черный ореол.

Рис. 9. При росте листерий в мясопептонном бульоне образуется помутнение с легкой опалесценцией.

Диагностика листериоза с помощью биологических проб

Биологические пробы основаны на заражении лабораторных животных биологическим материалом, взятого от больного, с целью обнаружения бактерий. Заражению подвергают белых мышей, кроликов, морских свинок, степных пеструшек.

Рис. 10. На фото зараженные листериозом белые мыши. В центре здоровый мышонок. Справа и слева от него мыши-сосунки с параличом передних лапок.

Рис. 11. На фото слева листериоз у кролика, развившийся после внутривенного заражения. На фото справа воспалительная реакция, развившаяся на месте внутрикожного введения листерий.

Антитела к листериям

Антитела к листериям определяются с помощью серологических реакций: реакции агглютинации (РА), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции связывания комплемента (РСК) с листериозным антигеном с постановкой в парных сыворотках. При наличии листериоза у больного нарастание титра регистрируется в 4 раза и более. Реакции проводятся дважды с 2-х недельным перерывом.

В связи с антигенным родством листерий и стафилококков, возможно получение ложноположительных результатов.

Через 2 недели от начала заболевания в крови больного выявляются антитела IgG, которые присутствуют в крови на протяжении всего периода заболевания. Длительное время антитела сохраняются в крови при хроническом течении листериоза.

Метод флуоресцирующих антител

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — экспрессный и высокочувствительный метод диагностики листериоза. Существует прямой и непрямой метод РИФ. При определении антител прямым методом к взвеси микробов, зафиксированной на предметном стекле, добавляется сыворотка, меченная флуорохромом. При образовании комплекса антиген-антитело при освещении сине-фиолетовыми (ультрафиолетовыми) лучами бактерии светятся ярко-зеленым цветом в люминесцентном микроскопе.

Рис. 12. Свечение листерий при проведении реакции иммунофлюоресценции.

Кровь на листерии

Анализ крови на листерии является эффективным способом определения листериозной инфекции. При различных формах листериоза в организме больных, прежде всего, активизируется система мононуклеарных фагоцитов — макрофагов. Они захватывают и уничтожают бактерии и вирусы, живущие внутриклеточно, считывают информацию об их строении и передают ее Т-лимфоцитам. В дальнейшем В-лимфоциты начинают вырабатывать антитела, уничтожающие патоген. При заболевании количество моноцитов в периферической крови возрастает. При септической форме листериоза их количество достигает 70% (при норме 3 — 11%).

Рис. 13. На фото моноциты — самые крупные клетки периферической крови.

Внутрикожная проба на листериоз

Для диагностики листериоза используется внутрикожная (аллергическая) проба. Листериозный антиген вводится внутрикожно. Через 24 часа проводится изучение реакции. В случае наличия листерий в организме исследуемого на месте введения листериозного антигена коже появляется папула (инфильтрат) 10 и более миллиметров.

Внутрикожная проба ставиться на 6 — 9 день от момента заболевания.

В случае появления единичных случаев листериоза диагностика заболевания должна проводиться с использованием бактериологического метода и метода ПЦР.

Дифференциальная диагностика листериоза

Дифференциальная диагностика листериоза проводится с учетом развившейся клинической формы заболевания.

• Листериозные ангины следует отличать от стрептококковых ангин.
• Острые формы листериоза следует отличать от инфекционной эритемы, инфекционного мононуклеоза, острого токсоплазмоза, заболеваний крови.
• Нервные формы листериоза следует отличать от бактериальных менингитов разной этиологии — пневмококковых, менингококковых, стафилококковых.
• Листериоз беременных следует отличать от вялотекущих пиелоциститов и пиелонефритов.

докторант 1 курса КазНАУ,

Республика Казахстан, г. Алматы

докторант 1 курса КазНАУ,

Республика Казахстан, г. Алматы

докторант 1 курса КазНАУ,

Республика Казахстан, г. Алматы

докторант 1 курса КазНАУ,

Республика Казахстан, г. Алматы

докторант 1 курса КазНАУ,

Республика Казахстан, г. Алматы

BACTERIOLOGICAL DIAGNOSIS OF LISTERIOSIS OF BIRDS

Zhumagul Kirkimbaeva

dr. prof. of Kazakh National University,

Nurzhan Sarsembayeva

dr. prof. of Kazakh National University,

Sholpan Mustafina

candidate of veterinary Science, a senior fellow at the Kazakhstan-Japan Innovation Center,

Nailya Bekturova

doctoral student Kazakh National University,

Dinara Bolatbekova

master student Kazakh National University,

АННОТАЦИЯ

Проведено бактериологическое исследование патологического материала от павших птиц. Результаты анализа клиники, патологоанатомических признаков, а также биологических свойств выделенной культуры доказывает принадлежность их к виду Listeria monocytogenes. Культура Listeria monocytogenes обладала типичными биологическими свойствами: культуральные свойства на жидкой, твердой и дифференциально-диагностической питательных средах, морфология бактериальных клеток на окрашенных по Граму мазках, характерное сбраживание углеводов, каталазная активность суточной культуры.

ABSTRACT

A bacteriological examination of pathological material from dead birds has been conducted. The results of the analysis of clinic, pathological features, as well as the biological properties of the selected culture proves that they belong to the species – Listeria monocytogenes. Culture of Listeria monocytogenes had the typical biological properties: cultural properties on the liquid, solid and differential diagnostic nutrient media, morphology of bacterial cells on Gram-stained smears, characterized by the digestion of carbohydrates, cat alase activity of daily culture.

Ключевые слова: листериоз, токсикоинфекция, диагностик, клинические признаки, бактериологическое исследование, питательные среды.

Keywords: listeria, toxicoinfection, diagnosis, clinical signs, bacteriological research, culture media.

Современное птицеводство является высокодоходной отраслью, оно дает народному хозяйству и населению страны ценное сырье и продукты питания. Поставлены задачи по обеспечению возрастающих потребностей населения в мясе и доведение уровня производства мяса и продукции из него до уровня потребления сравнимого с развитыми европейскими странами [1, с. 192].

Приоритетными должны стать показатели конкурентоспособности отечественной продукции, соответствия их качества международным требованиям, что обеспечит эффективность отрасли в условиях открытой мировой системы торговли, в области птицеводческой деятельности.

При этом пристальное внимание уделять безопасности получаемых продуктов птицеводства, так как пищевые токсикоинфекции в птицеперерабатывающей промышленности по-прежнему представляют весьма актуальную проблему. Эта задача остаётся не менее важной в связи с созданием Таможенного союза и вступлением Казахстана в ВТО.

Наибольшую опасность для потребителя представляет продукты птиц, больной инфекционными болезнями, в том числе листериозом. К настоящему времени листериоз птиц зарегистрирован в более чем 50 странах мира, где он наносит весьма существенный экономический ущерб и осложняет эпидемиологическую обстановку [4].

Листерия – это грамположительная факультативно-анаэробная палочка, не образующая спор, она выделяется из почвы, воды, пыли, сточных вод и др. широко распространены в природе и носителями являются десятки видов домашних животных и диких млекопитающих, птиц. Большинство носителей листерий по внешним признакам выглядят вполне здоровыми.

Диагностика листериоза представляет значительные трудности в связи из-за полиморфизма клинических проявлений и невозможности в ряде случаев выявить источник инфекции, поэтому решающее значение приобретает лабораторная диагностика. Установить диагноз «листериоз» можно только бактериологическим методом. Для выделения листерии из стерильных биологических субстратов не требуется каких-либо специальных сред или условий культивирования: листерии хорошо растут на кровяном и шоколадном агаре. Другие виды клинического материала контаминированы разнообразной микрофлорой, а количество листерий в них может быть незначительным, и выделить их удаётся лишь с помощью селективных питательных сред или процедуры обогащения [5, c. 849].

В настоящее время экспресс-диагностика листериоза основана на ПЦР. При определении специфических антител доступными в настоящее время методами имеют место как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты исследований [2].

Цель исследований: изучить ситуацию по листериозу в Алматинской области на птицефабриках путем выделения и идентификации возбудителя болезни, вызвавшей гибель птиц.

Материалы и методы исследования. Работа по мониторингу листериоза бактериологическими методами выполнена в Казахстанско-Японском инновационном центре, а также на птицефабриках Алматинской области РК, проводили исследования по обнаружению возбудителя листериоза за период 12.12.2015 по 12.02.2016 г.

Диагностические исследования проводились с использованием бактериологических методов. Материалом для бактериологического исследования служили грудные и бедренные мышцы, мозг, а также внутренние органы (печень, сердце) и корм. Микробиологические показатели определяли в образцах мяса, а также печени и мозге в свежем виде сразу после убоя. Микробиологический анализ проводили согласно СТ РК ГОСТ Р 51921-2002 и методическому пособию.

В лабораторию микробиологической безопасности Казахстанско-Японского инновационного центра КазНАУ были доставлены трупы павших птиц в количестве 15. Заболевание протекало в острой и подострой форме и характеризовалось следующими клиническими признаками: у больных птиц отсутствовал аппетит, были малоподвижны, наблюдался конъюнктивит, учащение дыхания, прогрессирующая слабость, судороги и параличи ног, крыльев, мускулатуры шеи («мягкая шея»), истощение.

В паренхиматозных органах павших птиц наблюдались характерные патологоанатомические изменения: изменен цвет паренхимы печени, мягкой консистенции; селезенка кровенаполнена, темного цвета; паренхима почки мягкой консистенции, цвет изменен, сосуды серозной оболочки мозга инъецированы, сами оболочки разрыхлены, тусклые, местами на них видны кровоизлияния.

Для бактериологического исследования пробы были в соответствии с ГОСТ 21237-75.

Посевы суспензии из головного мозга и паренхиматозных органов на физиологическом растворе в соотношении 1:5 делали на питательные среды МПБ (мясо-пептонный бульон), МПА (мясо-пептонный агар). Посевы культур выращивали в термостате при 25°С. Из головного мозга и печени готовили мазки-отпечатки. Мазки из суточных колоний листерий и мазки-отпечатки окрашивали по Граму [3, c. 90].

Предназначенные для идентификации 24 – часовые бульонные культуры, выращенные при 25˚С, бактериологической петлей засевали частым штрихом на 2 пробирки МПА, так, чтобы получить рост по всей поверхности агара, выращивали при комнатной температуре 24–30 часов.

Через 24 ч культивирования посевов в термостате при 25°С в МПБ наблюдалось легкое равномерное помутнение бульона, на МПА выросли колонии мелкие, росинчатые, блестящие, вязкой консистенции, в проходящем свете наблюдали нежный рост колоний – мелкие выпуклые беловатые колоний как беловатый налет на агаре (Рис. 1).

Рисунок 1. Рост листерий на МПА

Рисунок 2. Рост листерий на кровяном агаре

Через 24 ч при появлении сплошного роста колоний бактериологической петлей производили, пересев на селективную диагностическую среду Palkam и кровяной агар. Через 24 часа инкубирования на селективной среде Pаlcam отмечался обильный рост мелких, серовато-зелёных или зелёных колоний, диаметром 0,5–1,0 мм. При появлении сплошного роста колоний листерий производили, пересев бактериологической петлей из зон наибольшего почернения среды штрихами на 2–3 чашки Петри с селективной дифференциально-диагностической средой для получения изолированных колоний. На кровяном агаре у выделенных культур обнаруживали зону гемолиза различной интенсивности (Рис. 2). Бактериальную массу из выросших изолированных колоний использовали для приготовления препаратов и окрашивания по Граму.

В окрашенных по Граму препаратах бактерии рода листерия установлены в виде коротких палочек, располагающихся одиночно и попарно. Возбудитель листериоза представляет собой грамположительные с закругленными концами палочки, которые могут быть полиморфными. Характерной особенностью листерий является то, что некоторые бактерий располагаются по отношению друг к другу в виде римской цифры V или параллельно. Суточная культура листерий, выделенная от бройлера, представлена на рис. 3.

Рисунок 3. Культура листерий в мазке, окрашенном по Граму

При посеве выделенных культур на углеводные среды получены следующие результаты.

Таблица 1.

Биохимические свойства выделенных культур листерий

Серологическая диагностика

Применяют РСК с метаноловым экстрактом из M. paratuberculosis в каче­стве антигена. Сыворотки крови инактивируют при 61- 62° С в течение 30 минут, исследуют в разведении 1:10. Комплемент берут в дозе на два интер­вала выше его титра. Время 1-й и 2-й фаз РСК — 20 мин при 37-38° С в водяной бане. Задержку гемолиза на два и более креста оценивают как положительный, на один крест — сомнительный результат. В последнем случае сыворотку исследуют повторно через 15-20 дней.

Испытаны для этих же целей ELISA-тест, РДП.

Из современных методов диагностики применяют ПЦР для обнаруже­ния ДНК возбудителя в фецес.

Листериоз — инфекционная болезнь, протекающая с признаками пораже­ния центральной нервной системы, половых органов (аборты, метриты), молочной железы (маститы), в виде общего лихорадочного заболевания. К листериозу восприимчивы овцы, козы, крупный рогатый скот, свиньи, ло­шади, кролики, куры, гуси, утки, индейки, а также человек. В настоящее время листериоз рассматривают как одну из важных пищевых инфекций.

Возбудитель листериоза — L. monocytogenes, грамположительная, не-спорообразующая, палочковидная подвижная бактерия, относящаяся к роду Listeria. Аборты у овец может вызывать вид L. ivanovii.

Лабораторная ди­агностика основана на результатах бактериологического и серологичес­кого исследований.

Бактериологическое исследование.Для исследования направляют при наличии маститов в лабораторию направляют молоко из пораженных до­лей вымени, в случае абортов – плаценту (котиледоны), истечения из половых органов. Трупы мелких животных посылают целиком, от крупных живот­ных голову (головной мозг), части печени, селезенку, почки, пораженные учас­тки легких. В случае необходимости материал консервируют 30%-ным водным раствором глицерина. Для целей серологической диагностики от больных и по­дозрительных по заболеванию животных берут пробы крови (сыворотку).

Микроскопическое исследование исходного материала.Для увеличения концентрации клеток целесообразно подращивание проб при температуре 37° С в течение 5-6 часов. Мазки из исследуемого материала окрашивают по Граму. В препаратах листерий видны как полиморфные, чаще палочковидные, иногда кокковидной формы грамположительные бактерии размером 0,6 х 2 мкм. Капсул и спор не образуют. При наличии соответству­ющих реагентов проводят выявление и идентификацию листерий методом флуоресцирующих антител или иммунопероксидазным методом. Разработа­ны тест-системы для обнаружения ДНК возбудителя в полимеразной цепной реакции

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Для студента самое главное не сдать экзамен, а вовремя вспомнить про него. 10007 – | 7489 – или читать все.