Цель занятия: изучить методы диагностики сибирской язвы. Материалы и оборудование: световой микроскоп, вакцина против сибирской язвы.
Место проведения занятия: лаборатория кафедры эпизоотологии.
Сибирская язва — остропротекающая болезнь сельскохозяйственных животных многих видов. Болеет и человек. Возбудитель — Bacillus anthracis.
При постановке диагноза на сибирскую язву используют весь комплекс диагностических методов — эпизоотологический анализ, клинические, патологоанатомические и лабораторные исследования.
Общий принцип эпизоотологического анализа, или обследовав ния, хозяйства изложен в занятии 6. Возбудитель сибирской язвы может распространяться через секреты и экскреты больных животных, продукты убоя, трупы, а также посредством кровососущих насекомых. Особенно опасны места захоронения трупов животных и стоячие водоемы.
Если болезнь возникла в период стойлового содержания животных, выясняют условия их кормления и происхождение кормов (споры сибирской язвы могут быть занесены с корнеплодами, сеном и мясокостной мукой); если в пастбищный период — обследуют участки, где паслись животные. Необходимо выяснить, велись ли вблизи фермы или пастбищ земляные работы, и собрать сведения за предельно большой срок о случаях появления сибирской язвы в данной местности.
Клиническое обследование животных начинают с измерения температуры тела (при сибирской язве она повышена). Болезнь выражается также отказом от корма, резким припуханием лимфатических узлов, отеком подчелюстного пространства, у дойных коров — Маститом. У свиней обнаруживают разлитую отечность тестоватой Консистенции в подчелюстном пространстве.
При патологоанатомическом исследовании отмечают характерные для сибирской язвы признаки: отсутствие трупного окоченения, сильное вздутие трупа, отеки в подкожной клетчатке, пенисто-кровянистые истечения из естественных отверстий, синюшную окраску видимых слизистых оболочек и кровоизлияния на них. Однако следует иметь в виду, что весь комплекс указанных изменений наблюдают не всегда, поэтому окончательный диагноз устанавливают только после лабораторного исследования.
Лабораторная диагностика при сибирской язве включает в себя микроскопию мазков из исходного патологического материала, выделение чистой культуры посевом на питательные среды, биопробу. При необходимости ставят реакцию преципитации, идентифицируют выделенные культуры культурально-биохимическими методами.
Для исследования на сибирскую язву в лабораторию направляют ухо, перевязанное у основания, или мазок крови, взятой из надреза уха; от трупов свиней — участки отечной соединительной ткани и заглоточные, а также другие лимфатические узлы с характерными патологоанатомическими изменениями. Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного (кроме трупов свиней), вскрытие прекращают и на исследование направляют часть селезенки.
Мазки микроскопируют немедленно, результаты срочно сообщают в хозяйство, направившее материал. Мазки фиксируют этиловым спиртом с добавлением 3 % пероксида водорода, окрашивают по Граму, на капсулы — по методу Ребигера, Михина, Ольта или Романовского— Гимзы и на споры — по методу Пешкова, Ауески, Трихинелье и Златогорова. Если в лаборатории есть люминесцирующие сыворотки, используют метод флюоресцирующих антител.
В мазках, окрашенных по Граму, сибиреязвенные бактерии располагаются короткими цепочками или попарно, концы, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. При окраске на капсулы мазков из свежего материала сибиреязвенные палочки окружены капсулой, из несвежего —бактерии несколько увеличены, иногда отмечают «тени», а вместо капсул — слабоокрашенные обрывки. При обработке препаратов люминесцирующими сыворотками в мазке обнаруживают специфическое свечение, свидетельствующее о наличии в исследуемой пробе возбудителя сибирской язвы.
Посевы из исходного материала делают в МПБ и на МПА или в бульон и на агар Хоттингера. Посевы инкубируют 18…24 ч при температуре 37 °С, при отсутствии роста выдерживают при той же температуре еще 48 ч.
После суточного роста сибиреязвенных бактерий МПБ остается прозрачным, на дне образуется рыхлый осадок, напоминающий комок ваты. При встряхивании пробирки бульон не мутнеет, осадок разбивается на мелкие хлопья. Мазки из бульонной культуры окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. В мазках обнаруживают цепочки, состоящие из сибиреязвенных палочек.
На плотных питательных средах возбудитель сибирской язвы образует плоские матово-серые шероховатые колонии. Центр колоний затемнен, периферия бахромчатая, с локонообразными отростками.
Для биопробы используют лабораторных животных, восприимчивых к сибирской язве: белых мышей, кроликов, морских свинок. Исследуемый материал суспендируют в небольшом объеме 0,9%-го раствора хлорида натрия, вводят двум белым мышам в дозе 0,2…0,5 мл под кожу спины ближе к корню хвоста или 0,5…1,0 мл двум морским свинкам подкожно в область живота. За животными, зараженными суспензией из исходного материала или культурой возбудителя, наблюдают в течение 10 сут. Зараженные животные гибнут через 1…3 сут, иногда позже. Трупы вскрывают, делают мазки и посевы на питательные среды из крови сердца, селезенки, печени, а также инфильтрата, образовавшегося на месте инъекции исследуемого материала.
Сроки исследований: микроскопического — в день поступления материала, бактериологического—до 3 сут, биологического (биопроба) — 10 сут.
Кожевенное сырье на сибирскую язву исследуют в реакции преципитации (РП). Перед ее постановкой свежий патологический материал предварительно выдерживают в термостате в течение 18…20 ч, несвежий сразу экстрагируют горячим или холодным способом. При этом следует учитывать, что в экстрактах, полученных горячим способом, меньше преципитиногенов.
При горячем способе экстрагирования кусочки исследуемого материала (1…2г) помещают в пробирку или колбу, заливают 0,9%-м раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 10 и кипятят 30…40 мин на водяной бане. При холодном кусочки материала (1…2г) растирают в ступке с песком, переносят в колбу или баночку, заливают 0,9%-м фенолизированным раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 10 и оставляют на 16…18 ч при температуре 20 ± 2 °С.
Полученные экстракты фильтруют через асбестовую вату до ‘ прозрачности, при этом первые капли фильтрата удаляют.
РП ставят методом наслаивания или подслаивания.
При наслаивании в уленгутовскую пробирку наливают 0,2…0,3 мл прозрачной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, затем осторожно наслаивают равное количество экстракта так, чтобы между. Компонентами образовалась ясно выраженная граница (тонкая прямая линия). При подслаивании в уленгутовскую пробирку сначала вносят 0,2…0,3 мл экстракта, затем под него осторожно пастеровской пипеткой подслаивают равное количество преципитирующей сыворотки.
Если при соединении компонентов резко выраженная граница между ними отсутствует, опыт повторяют. Одновременно ставят контроль преципитируюшей сибиреязвенной сыворотки со стандартным сибиреязвенным антигеном: при положительной реакции в течение 1…2 мин после соединения компонентов появляется характерное кольцо.
РП считают положительной, если через 1…2 мин и не позже чем через 15 мин на границе между компонентами появилось тонкое беловатое кольцо.
При отрицательном результате РП с экстрактом, полученным горячим способом, опыт повторяют с экстрактом, полученным холодным способом.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Приготовить мазки из вакцинного штамма и промикроскопировать их.
2. Разработать схему дифференциальной диагностики сибирской язвы от коликов, тимпании, отравления.
Основным источником инфекции являются больные травоядные животные, от которых человек заражается при непосредственном контакте, алиментарным, аэрогенным или трансмиссивным путями. Чаще всего возникает кожная форма инфекции с образованием характерного сибиреязвенного карбункула в виде уголька (anthrax), реже – кишечная, легочная, септическая формы. Методы микробиологической диагностики сибирской язвы отражены в схеме 6.
Схема 6. Микробиологическая диагностика сибирской язвы
| Материал: отделяемое карбункула или язвы, испражнения, моча, мокрота, кровь |
| Серологический метод Постановка РНГА, РА с целью определения антител в крови больного |
| Аллергодиагностика Постановка внутрикожной аллергической пробы с тулярином. Учет через 24-48 часов. |
| Выявление сибиреязвенного антигена Постановка реакции термопреципитации Асколи с преципитирующей противосибириязвенной сывороткой |
Микроскопический метод.Мазки из исследуемого материала окрашивают по Граму, Романовскому-Гимзе, Ребитеру (капсула), а также люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой. Обнаружение в препаратах окруженных капсулой крупных грамположительных бацилл в виде цепочек дает возможность поставить предварительный диагноз сибирской язвы (рис.11 а). В качестве экспресс-метода диагностики применяется РИФ, с помощью которой выявляют характерные сибиреязвенные бациллы в виде палочек со светящимся желто-зеленым ободком (рис. 11 б.).
Бактериологический метод –посев исследуемого материала на МПА, кровяной агар в чашках Петри или PLET-arap с полимиксином В, лизоцимом, этилен-диаминотетраацетатом (ЭДТА) и ацетатом таллия. Контаминированный материал из внешней среды, от животных, из старых трупов предварительно прогревают при 63 °С в течение 15 мин с целью уничтожения вегетативных форм микроорганизмов. Посевы помещают в термостат на сутки. Через 20 —24 ч инкубации посевов при 37 0 С на МПА обнаруживают характерные шероховатые колонии в виде «головы медузы», края которых при малом увеличении микроскопа имеют вид вьющихся локонов или «львиной гривы» – рис. 12. В бульоне характерен придонный рост, напоминающий комочек ваты, при этом среда остается прозрачной. Из осадка делают мазок и препарат висячей капли. В мазке обнаруживают бескапсульные грамположительные стрептобациллы (расположение в виде длинных цепочек в виде «бамбуковой палки»). В отличие от других почвенных бацилл возбудитель сибирской язвы неподвижен. Для выделения чистой культуры типичные колонии пересевают на скошенный МПА.
Капсулообразование можно выявить путем биопробы или при посевах в бульон Хоттингера, на специальную среду, содержащую раствор Хенкса и 40 % стерильной сыворотки крупного рогатого скота, МПА с 0,7 % бикарбоната натрия, среду Буза (3%голодный агар с 15% дефибринированной крови барана), а также в дефибринированную лошадиную кровь. Посевы выращивают в течение 18-24 часов при температуре 37 0 С в атмосфере 5-7% СО2.
А б
Рис. 11. Возбудитель сибирской язвы(Bacillus anthracis). а – окраска по Граму, б – РИФ. х630
Рис. 12. Колония Bacillus anthracis. х56
Идентификацию выделенной культуры Bacillus anthracis (3-й день исследования) и ее дифференциацию от сходных непатогенных бацилл проводят путем посева уколом в желатину (разжижение в виде елочки, перевернутой вершиной вниз), изучения биохимических свойств, фаголизабельности и заражения животных. Определяют также чувствительность культуры к антибиотикам.
Одним из характерных признаков возбудителя сибирской язвы является тест «жемчужного ожерелья».На поверхность МПА в чашке Петри с 0,5 и 0,05 ЕД/мл пенициллина засевают 3-часовую бульонную культуру выделенного микроорганизма, через 3 ч инкубирования при 37 0 С готовят мазки, в которых при микроскопии находят «жемчужные ожерелья» в виде округлившихся стрептобацилл сибирской язвы. Почвенные бациллы сохраняют форму палочек, расположенных цепочками.
Биологические свойства возбудителя сибирской язвы и сходных с ним бацилл отражены в табл. 7.
Наличие сибиреязвенного антигенав разложившемся трупе животного, коже (свежей, сухой, выделанной) и изделиях из нее, шкурках, мехе, шерсти определяют с помощью реакциитермопреципитациипо Асколи.Исследуемый материал измельчают, заливают 10 —20-кратным объемом физиологического раствора, кипятят в течение 10-45 мин., после чего фильтруют. Полученный экстракт осторожно наслаивают на преципитирующую сибиреязвенную сыворотку в узкой преципитационной пробирке. На границе экстракта и преципитирующей сыворотки в течение 1- 5 мин в случае положительной реакции появляется кольцо белого цвета (преципитат). Контроли включают постановку реакций с заведомо положительной и отрицательной сывороткой, нормальной сывороткой и т.д.
Биопроба.Исследуемымматериалом подкожно заражают двух белых мышей., которые погибают через 24-48 ч после заражения. В мазках из внутренних органов и крови обнаруживают типичные капсульные бациллы. Проводится бактериологическое исследование трупа белой мыши с целью выделения чистой культуры сибиреязвенных бацилл.
Таблица 7. Дифференциально-диагностические признаки сибиреязвенной и других бацилл
| Признак | Вид микроорганизмов | |||||
| Bacillus anthracis | Bacillus cereus | Bacillus mycoides | Bacillus thuringiensis | Bacillus subtilis | Bacillus Megaterium | |
| Капсула | + | – | – | – | – | – |
| Подвижность | – | + | – | + | + | + |
| Гемолиз | – | + | – | + | – | + |
| Рост в анаэробных условиях | + | + | + | + | – | – |
| Лецитиназа | + | + | + | + | – | – |
| Аргининдегидролаза | – | V | V | + | – | – |
| Нитpaтpeдyктaзa | + | + | + | + | + | – |
| Патогенность для мышей | + | – | – | – | – | – |
| Ферментация до кислоты: | ||||||
| глицерина | – | V | + | + | + | + |
| маннита | – | – | – | – | + | + |
| салицина | – | V | + | + | + | + |
Обозначения: «-« – отрицательная; «+» – положительная; «V» – вариабельная реакции.
Серологический методвыполняетсяв тех случаях, когда не удается обнаружить возбудителя в материале. Для определения антител в сыворотке крови больного используют реакции латекс-агглютинации и РНГА с протективным сибиреязвенным антигеном.
Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы с аллергеном сибиреязвенной бациллы – антраксином. Результаты учитывают через 24 ч. Пробу считают положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Сдача сессии и защита диплома – страшная бессонница, которая потом кажется страшным сном. 8753 – 
| 7139 – 
или читать все.
78.85.4.207 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
| Случаи, вызывающие подозрение на сибирскую язву | ||
| Эпизоотологические данные | Клинические признаки | Патологоанатомические изменения |
| Внезапная гибель животных при пастбищном содержании на ранее неблагополучной территории или после проведения земляных работ, сильного ливня или паводка | У овец — тяжелое дыхание дрожь, судороги, из носовых отверстий и полости рта выделяется кровянистая пена. У лошадей и крупного рогатого скота — озбуждение, сменяющееся угнетением, одышка, синюшность слизистых оболочек, температура до 41. 42 "С, гибель в судорогах | Быстрое разложение трупов, отсутствие их окоченения, наличие кровянистых истечений. В области нижнечелюстного пространства, щек, подгрудка, живота могут быть.тестоватые припухлости |
| Клинико-эпизоотологическое обследование хозяйства, комплексное лабораторное исследование животных и объектов внешней среды | ||
| Бактериологическое | Серологическое | Аллергическое |
| 1. Микроскопическое 2. Посев на питательные среды 3. Идентификация выделенной культуры по культуральным и биохимическим свойствам 4. Заражение лабораторных животных 5. Обнаружение возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней среды | РП по Асколи (при иссле довании кожевенного сырья, загнившего патматериала) РНГА, МФА, ELISA | использование сибиреязвенвенного аллергена для постановки прижизненного диагноза у свиней и оценки иммунитета у привитых против сибирской язвы лошадей, у крупного и мелкого рогатого скота |
Взятие материала от вынужденно убитых животных и его исследование проводят в соответствии с действующим ГОСТ 21234—75 «Мясо. Методы бактериологического анализа», действующими Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов.
По результатам лабораторных исследований диагноз на сибирскую язву считается установленным при получении одного из следующих показателей: 1) выделения из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя сибирской язвы, и гибели хотя бы одного лабораторного животных из двух зараженных исходным материалом или полученной культурой с последующим вьщелением ее из органов павшего животного; 2) отсутствии в посевах из исходного материала роста культуры, но гибели хотя бы одного лабораторного животного из двух зараженных и выделению из его органов культуры с признаками, характерными для возбудителя сибирской язвы; 3) положительной реакции преципитации при исследовании кожсырья и загнившего патологического материала.
Для дифференциации возбудителя сибирской язвы от микробов-сап-рофитов, близкородственных В. anthracis (В. cereus, В. mycoides, В. thuringiensis и др.), широко распространенных в природе, применяют методы, выявляющие фенотипические различия штаммов, в том числе определение характера роста на различных питательных средах, чувствительность к пенициллину и бактериофагу, образование капсул, тест на образование сибиреязвенного токсина, РП в геле, РИГА в комплексе с другими бактериологическими методами (микроскопия, культивирование, биопроба на лабораторных животных) и др.
Для выявления обсемененности спорами сибирской язвы различных объектов внешней среды разработаны Методические указания по индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды и кормах с помощью твердофазного иммуноферментного метода.
В настоящее время для проведения более тонкого и углубленного эпи-зоотологического анализа вспышек болезни разработаны рестрикцион-ный анализ, молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция (ПЦР).
При дифференциальной диагностике у коров необходимо исключить эмфизематозный карбункул, злокачественный отек, пастереллез (отечная форма) и пироплазмидозы, тимпанию незаразного характера, лейкоз. У овец — брадзот, инфекционную энтеротоксемию и пироплазмидозы; у свиней — рожу, чуму, пастереллез; у лошадей — злокачественный отек, сверхострое течение инфекционной анемии, пироплазмидозы, петехиальную горячку, кормовые отравления.
Основой дифференциальной диагностики является комплексный метод исследования, в котором результаты лабораторной диагностики имеют решающее значение.
Иммунитет, специфическая профилактика.У переболевших сибирской язвой животных развивается стойкий и продолжительный иммунитет. Основу профилактики и борьбы с сибирской язвой в настоящее время составляют средства специфической профилактики — вакцины. Длительно в нашей стране применялась вакцина СТИ, в настоящее время для создания активного искусственного иммунитета широко используют живую споровую лиофилизированную вакцину из штамма 55-ВНИИВВиМ и аналогичную жидкую вакцину. Иммунитет формируется через 10 дней после прививки и сохраняется более 1 года. Разработаны две формы сибиреязвенной вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ: концентрированная и суперконцентрированная, и способ их внутрикожного применения при помощи безыгольного инъектора (крупный рогатый скот, свиньи).
Создана также универсальная вакцина против сибирской язвы человека и животных «УНИВАК», которую вводят безыгольным способом или подкожно шприцем. Иммунитет развивается через 7 дней, продолжительность 1,5 года.
Возможно использование ассоциированных вакцин: против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула; против сибирской язвы и ящура; против сибирской язвы и клостридиозов овец; против сибирской язвы и оспы овец.
Разрабатываются также современные сибиреязвенные вакцины нового поколения с получением рекомбинантных штаммов, обеспечивающих формирование более длительного иммунитета.
Профилактика.Для предупреждения сибирской язвы проводят общие ветеринарно-санитарные мероприятия. Определяют эпизоотическую ситуацию местности, изучают распространение болезни в прошлые годы, чтобы, проанализировав данные, прогнозировать ее появление и осуществлять необходимые меры профилактики. Основные профилактические мероприятия в стационарно неблагополучных по сибирской язве хозяйствах перечислены на рисунке 1.1.
Лечение.Больных животных немедленно изолируют и лечат. Для лечения применяют гипериммунную противосибиреязвенную сыворотку, специфический гамма-глобулин, которые рекомендуется сочетать с инъекциями антибиотиков. Разработана и предложена схема комплексного применения антибиотиков при лечении сибирской язвы у животных разных видов. В период вспышки болезни используют антибиотики в следующих комбинациях: тетрациклин + стрептомицин, тетрациклин + эритромицин, тетрациклин + ампицилин для лечения (в течение 7. 10 дней) и профилактики (в течение 5. 7 дней).
Меры борьбы.В соответствии с санитарными и ветеринарными правилами «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных» (1996) при организации противосибиреязвенных мероприятий следует различать эпизоотический очаг, стационарно неблагополучныи пункт, почвенный очаг, эпидемический очаг и угрожаемую территорию.
Рис. 1.1. Профилактические мероприятия при сибирской язве
Эпизоотический очаг сибирской язвы — место нахождения источника или факторов передачи возбудителя инфекции в тех пределах, в которых возможна передача возбудителя восприимчивым животным или людям (участок пастбища, водопой, животноводческое помещение, предприятие по переработке животноводческой продукции и т. д.).
Стационарно неблагополучный пункт — населенный пункт, животноводческая ферма, пастбище, на территории которых обнаружен эпизоотический очаг независимо от срока давности его возникновения.
Почвенными очагами считаются скотомогильники, биотермические ямы и другие места захоронения трупов животных, павших от сибирской язвы.
Эпидемическим очагом сибирской язвы является эпизоотический очаг, в котором отмечено заболевание этой инфекцией человека.
Угрожаемой территорией считаются хозяйства, населенные пункты, административные районы, где имеется угроза заболевания животных или человека.
При получении заключения о наличии сибирской язвы администрация территории по представлению ветеринарной и санитарно-эпидемической службы устанавливает карантин. Основные мероприятия по ликвидации представлены на рисунке 1.2.
При отсутствии у животных осложнений после вакцинации карантин снимают через 15 дней со дня последнего случая падежа или выздоровления больного животного.
Меры по охране людей от заражения сибирской язвой.Сибирская язва у человека может возникнуть в результате заражения от больного животного, его трупа, употребления инфицированных продуктов животноводства (использование в пищу молока, мяса) или через зараженную сибиреязвенными спорами почву. Заражение может осуществляться контактным, трансмиссивным, алиментарным или воздушно-пылевым путем. Сибирская язва у человека чаще всего проявляется как инфекция наружных покровов, реже — в кишечной или легочной форме. Кожная форма болезни встречается в 95. 97 % случаев и характеризуется сравнительно легким клиническим проявлением.
Опасность заражения людей существует, поэтому вакцинации подлежат лица, по роду деятельности подвергающиеся риску заражения в процессе манипуляций с материалами, подозрительными на обсемененность возбудителем, или при работе с культурами возбудителя сибирской язвы. Обязательны госпитализация и лечение больных, а также санитарно-просветительская работа среди населения.
Рис. 1.2. Мероприятия по ликвидации сибирской язвы 
Дата добавления: 2015-03-14 ; просмотров: 1281 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ